GSEA富集分析+R分析+多类美化工具

• 相关原理详细介绍
  生信技能树详解GSEA
  一文快速get GSEA富集分析是什么，怎么用？
  基因集富集分析

一.GSEA富集分析定义

GSEA（Gene Set Enrichment Analysis），是一种基于基因集的富集分析方法。具体介绍查阅Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles
GSEA的适用场景是：在两种不同的生物学状态下，可以理解为处理组与对照组，判断某一组基因集其表达模式更接近于那种过程或者通路，从而推断这些基因对这个生物学过程的重要贡献。在分析结果上GSEA也是更加可靠，可信度较高的。

二.GSEA富集分析优势

  基因表达分析的传统策略侧重于识别在两种感兴趣状态之间表现出差异的单个基因。尽管有用，但它们无法检测分布在整个基因网络中并且在单个基因水平上差异小的生物过程，例如代谢途径、转录程序和压力反应。但基因富集分析（GSEA）不需要指定明确的差异基因阈值，把基因按照在两组样本中的差异表达程度进行排序，然后采用统计学方法检验预先设定的基因集合是否在排序表的顶端或低段富集。

  与单基因方法相比，GSEA 具有许多优势。
    首先，它通过识别路径和过程简化了对大规模实验的解释。研究人员可以专注于基因组，而不是专注于高分基因（可能注释不佳且可能无法重现），这往往更具重现性和可解释性。
    其次，当基因组的成员表现出很强的互相关性时，GSEA 可以提高信噪比，并使检测单个基因的适度变化成为可能。
    第三，前沿分析可以帮助定义基因子集以阐明结果。
    第四，常规的超几何富集分析富集到某个通路时会出现这种情况，这条通路既有上调的差异基因又有下调的差异基因，那么这条通路总体是被抑制还是激活是不清楚的。GSEA是基于基因集的富集分析方法，对基因表达量数据进行分析时，选择一个或多个功能基因集进行分析（以某个kegg通路为例，可以认为一个基因集），基因表达量的数据与表型或者不同样本的关联度进行排序，然后判断每个基因集内的基因是否位于基于表型相关度排序后的基因列表的上部或者下部，来判断词基因集内的基因协同变化对表型或不同处理样本的影响。

三.数学原理

1.输入文件：

    GSEA的输入是一个基因表达量矩阵，其中的样本分成了A和B两组，找到两组之间差异表达的基因，然后根据foldchange进行排序，用来表示基因在两组间表达量的变化趋势。排序之后的基因列表其顶部可以看做是上调的差异基因，其底部是下调的差异基因。GSEA分析的是一个基因集下的所有基因是否在这个排序列表的顶部或者底部富集，如果在顶部富集，我们可以说，从总体上看，该基因集是上调趋势，反之，如果在底部富集，则是下调趋势。

image.png

• 所以需要输入的主要文件有：
  input data1 ：样本的全基因组RNA测序数据及样本的表型标签信息【样本数尽量多一些，否则假阳性高】
  input data 2：基于某个合适的指标（如差异倍数FC）对所有基因排序，获得排序基因列表L = {g1, g2, g3, g4, …… gN}；【需要注意的是这个基因排序在R语言中是一个带名字的向量】
  input data 3：功能基因集S
      一些已经预定义的功能基因集可以在MSigDB中下载
  
  image.png
  
      一般基因集都有两个常用版本，一种是SYMBOL ID版本，另一种是ENtrez ID版本，基因中所包含的基因名需要与第一部分文件中的基因名属于同一ID类型。
      下载的格式一般是 gmt（Gene Matrix Transposed，基因矩阵转置）文件，里面保存的是一些基因列表的信息。每一行代表一个基因列表，基因之间以制表符隔开。详细介绍请参看基因矩阵转置文件格式（* .gmt）以及R读取gmt文件

2.三个关键步骤：

GSEA主要包括三个步骤：计算富集得分（Enrichment Score）；估计富集得分的显著性水平；多重假设检验。

第 1 步：计算富集分数。我们计算了一个浓缩分数（ES），它反映了一个集合S在整个排序列表L的极端（顶部或底部）处被过度代表的程度。分数是通过遍历列表L来计算的，当我们遇到 S 中的基因时增加运行总和统计量，当遇到不在 S 中的基因时减少它。增量*的大小取决于基因与表型的相关性. ES即为该过程中的x的最大取值，对应加权的Kolmogorov-Smirnov样的统计量。

第 2 步：估计 ES 的显着性水平。我们通过使用基于经验表型的置换测试程序来估计ES的统计显着性（标称P值），该程序保留了基因表达数据的复杂相关结构。
    具体来说，构建零分布：对每个样本重新分配表型标签、重新排序所有基因、重新计算基因集S的ES值；以上过程重复1000次，该1000个ES值构成零分布（null distribution）。
    计算P值：绘制直方图，p值即为ESnull distribution中≥或≤ESobserved的比例。该p值为经验名义p值。
    结果解读：小于α值（如0.05），则拒绝零假设，认为基因集S在排序列表L的top端或bottom端富集；若≥α值，则接受零假设，认为兴趣基因集S内基因在排序列表L中随机分布。

第 3 步：调整多重假设检验。当评估整个基因集数据库时，我们会调整估计的显着性水平以考虑多重假设检验。
   我们首先基于基因集S大小，对ES进行标准化处理，从而产生归一化富集分数 ( NES )。然后我们计算每个NES对应的错误发现率 (FDR) 来控制误报的比例。
   FDR值代表，给定NES值对应的基因集为假阳性（富集）的估计概率；值越大，则假阳性的概率越大。它是通过比较NES*的观测分布和空分布的尾部来计算的。

四.结果解读

1.富集通路的分析

富集分析的结果结果，要综合考虑p值及ES值两个指标

image.png

S1：基因集S1主要分布在排序列表的top端，ES分值较高，p值显著；
S2：基因集S2在排序列表中随机分布，ES值低，p值不显著；
S3：基因集S3非随机分布，但也并不在top or bottom呈现集中分布模式，ES值较高，但p值不显著。

2.分析结果

image.png

• 1、图最上面部分展示的是富集分数（ES,enrichment score）值计算过程
    从左至右，每个基因计算一个ES值，连成线。在最左侧或最右侧有一个特别明显的峰值就是基因集表型上的ES值。图中间部分每一条线代表基因集中的一个基因，及其在基因列表中的排序位置。
    横轴为该基因下的每个基因，纵轴为对应基因的RunningES。
    在折线图中有个峰值，该峰值就是这个基因集的Enrichemntscore。一般关注基因集的Enrichemntscore，峰出现在前端还是后端(ES值大于0在前端，小于0在后端)

• 2、Leading-edge subset 对富集得分贡献最大的基因成员。
    若富集得分为正值，则是峰左侧的基因；若富集得分为负值，则是峰右侧的基因。
    这些基因代表基因集S中对ES值贡献最大的一小簇基因（核心基因）；也代表基因集中在兴趣生物学通路中发挥关键作用的核心成员。

• 3、中间部分展示的是基因与表型关联的矩阵。
    用线条标记位于基因集下的每个基因的位置，每个竖杠代表一个基因，竖杠的位置就是每个基因集里的基因在所有排序好的基因的位置。如果基因集里的基因集中在所有基因的前部分，就是在A组里面富集，如果集中在后面部分，就是在B组里面富集。
    红色为与第一个表型(class A)正相关，在class A中表达高，蓝色与第二个表型(class B)正相关，在class B中表达高。

• 4、最下面的展示的是所有基因的rank值分布图
    为所有基因的rank值分布图，纵坐标为ranked list metric，即该基因排序量的值，可理解为“公式化处理后的foldchange值”。即表示每个基因对应的信噪比（Signal2noise）。以灰色面积图显展示。灰色阴影的面积比，可以从整体上反映组间的Signal2noise的大小。

• 除了会看图形，我们也要关注一些主要的统计学指标：
  NES（校正后的富集分数）
  FDR（错误发现率）、p值：FDR<0.25,p<0.05且|NES|>1则表示结果有意义。

五.R语言分析

常用的方法有两种，一种是clusterProfiler包中的GSEA函数，另一种则是fgsea包中的fgsea方法

1.制作输入文件

#加载包
library(clusterProfiler)
library(gggsea)
library(ggplot2)
library(GSVA)
library(enrichplot)
library('GSEABase')
library(fgsea)
library(org.Hs.eg.db)
library(tidyverse)
library(dplyr)

 
#读取基因列表（包含基因名称以及 log2 转化后的 Fold Change 信息）
#根据logfc降序排列基因
load('deg.RData')
alldiff <- deg[order(deg$logFC,decreasing = T),]
genelist <- alldiff$logFC
names(genelist) <- rownames(alldiff)

#读取基因集（本示例使用的 MSigDB 数据库中的 hallmark）
#使用clusterProfiler中的read.gmt函数读取下载的gmt基因集文件
hallmark <- read.gmt("h.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt")

2.clusterProfiler分析

gsea.re1<- GSEA(genelist,  #待富集的基因列表
    TERM2GENE = hallmark,  #基因集
    pvalueCutoff = 1,  #指定 p 值阈值（可指定 1 以输出全部）
    pAdjustMethod = 'BH')  #指定 p 值校正方法
     
#GSEA(geneList, exponent = 1, nPerm = 1000, minGSSize = 10,
#       maxGSSize = 500, pvalueCutoff = 0.05, pAdjustMethod = "BH", TERM2GENE,
#       TERM2NAME = NA, verbose = TRUE, seed = FALSE, by = "fgsea")
##exponent: weight of each step
##nPerm置换检验的次数，默认为1000
##minGSSize富集到某个条目的最小包含基因数，如果基因数小于该值则这个条目将被过滤掉，默认为10
##maxGSSize富集到某个条目的最大包含基因数，如果基因数大于该值则这个条目将被过滤掉，默认为500
##verbose是否输出提示信息
##seed是否使结果具有可重复性
##by选择使用的统计学方法，默认为fgsea

#输出
write.table(gsea.re1, 'gsea_human_hallmark.txt', sep = '\t', row.names = FALSE, quote = FALSE)

#提取显著富集的基因集
g1<-as.data.frame(gsea.re1)
g1<-subset(g1,p.adjust<0.05)
g1<-g1[order(g1$NES,decreasing = T),]

• 输出结果
  image.png

  主要结果中包括：
    ID和Description，富集到的功能的id及其描述；
    setSize，该功能中包含表达数据集中的基因数目;
    enrichmentScore，富集得分，正得分可视为功能激活，负得分可视为功能抑制；
    NES，即normalized enrichment score，标准化的富集得分；
    pvalue、p.adjust和qvalue，p值、校正后p值和q值信息；
    rank，排名；
    core_enrichment：富集到该功能的核心基因列表。

3.fgsea分析

## 这里去掉了基因集前缀
hallmark$ont <- gsub('HALLMARK_','',hallmark$ont)
#[[代表提取元素，比如数据框中data[1]提取第一列，数据类型还是data.frame，data[[1]]提取第一列,数据类型是character
#下面表示取第二列，并表示为character
hallmark.list <- hallmark %>% split(.$ont) %>% lapply( "[[", 2)

gsea.re2 <- fgsea(pathways = hallmark.list,#基因集列表
                  stats = genelist,#排序后的基因level,这里是logFC
                  nperm=1000,#置换检验的次数
                  minSize=1,#富集到某个条目的最小包含基因数，如果基因数小于该值则这个条目将被过滤
                  maxSize=10000,#富集到某个条目的最大包含基因数，如果基因数大于该值则这个条目将被过滤
#                 nproc = 0#如果不等于零，则将 BPPARAM 设置为使用的nproc （默认值 = 0）。
#                 gseaParam = 1,#GSEA 权重参数（0 为未加权，建议值为 1）
#                 BPPARAM  = NULL,#Bplapply中使用的并行化参数。可用于指定要运行的群集。如果没有显式初始化或通过设置“nproc”默认值“，bpparam()”被使用
                    )

#提取显著富集的基因集
colnames(gsea.re2)
g2 <- gsea.re2[gsea.re2$padj<0.05,]
g2 <- g2[order(g2$NES,decreasing = T),]
#输出
save(gsea.re1,g1,gsea.re2,g2,file = 'gsea.RData')

• 输出结果

  
  
  image.png

pathway – name of the pathway as in 'names(pathway)';
pval – an enrichment p-value;
padj – a BH-adjusted p-value;
ES – enrichment score, same as in Broad GSEA implementation;
NES – enrichment score normalized to mean enrichment of random samples of the same size;
nMoreExtreme' – a number of times a random gene set had a more extreme enrichment score value;
size – size of the pathway after removing genes not present in 'names(stats)'.
leadingEdge – vector with indexes of leading edge genes that drive the enrichment

4.可视化展示

可以绘制富集气泡图、得分图、条形图等
GSEA集的结果的可视化有一些R包和函数，比如gseaplot、gseaplot2、gggsea、GseaVis等

• 气泡图

load('gsea.RData')
num<-g1[,c(1,11)]
#添加富集的核心基因个数
num<-num%>% separate_rows(core_enrichment, sep = "/")%>%group_by(ID)%>%count()
num<-num[match(g1$ID,num$ID),]
sum(num$ID==g1$ID)
g1$Count<-num$n
data<-g1%>%mutate(GeneRatio = Count/setSize)
data$sign<-ifelse(data$NES>0,"activated","suppressed")
data$Description<- gsub('HALLMARK_','',data$Description)

library(RColorBrewer)
library(wesanderson)
ggplot(data)+geom_point(aes(x=GeneRatio ,y=Description,colour=p.adjust,size=Count))+facet_grid(~sign,scales = "free") +scale_colour_gradientn(colors=wes_palette("Zissou1",80,type="continuous"))

image.png

• enrichplot

library(ggsci)
col_gsea1<-pal_simpsons()(16)

num1=1
gseaplot2(gsea.re1,geneSetID = rownames(g1)[1:num1],
              title = "",#标题
              color = col_gsea1[1:num1],#颜色
              base_size = 14,#基础大小
              rel_heights = c(1, 0.2, 0.4),#小图相对高度
              subplots = 1:3,#展示小图
              pvalue_table = FALSE,#p值表格
              ES_geom = "line"#line or dot
          )

#展示多个基因集，设置多个名称即可，比如这里展示4个，如果有特定基因集，定义完成后传入geneSetID参数即可
num2=4
gseaplot2(gsea.re1,geneSetID = rownames(g1)[1:num2],
          title = "",#标题
          color = col_gsea1[1:num2],#颜色
          base_size = 14,#基础大小
          rel_heights = c(1, 0.2, 0.4),#小图相对高度
          subplots = 1:3,#展示小图
          pvalue_table = FALSE,#p值表格
          ES_geom = "line"#line or dot
)

image.png

image.png

• fgsea

plotGseaTable(hallmark.list[g2$pathway],
              genelist , 
              gsea.re2,gseaParam = 0.5,
              colwidths = c(0.5,0.2,0.1,0.1,0.1)
)

image.png

• gggsea

names(hallmark.list)
se_hall<-c(head(g2$pathway,2),tail(g2$pathway,2))

#3 所选中的基因集
sig1<-g2[g2$pathway%in%se_hall,]

hallmark.se<-hallmark.list[sig1$pathway]
df.new <- gseaCurve(genelist , hallmark.se, sig1)

#主要由三部分组成
# ggplot() + geom_gseaLine(df.new) + theme_gsea() #曲线
# ggplot() + geom_gseaTicks (df.new) + theme_gsea()#竖线
# ggplot() + geom_gseaGradient(df.new) + theme_gsea()#色块

pal_line<-pal_lancet()(9)#各曲线颜色

ggplot() + 
  geom_gsea(df.new,
            prettyGSEA=T,
            tickcolor='grey30',#竖线颜色
            ticksize=0.1,#线条粗细
            #colour='grey',#色块边框
            linecolor=pal_line,
            linesize=2,lty=1,
            #多个图形时使用，设定每行列图形个数
            nrow = 2,
            ncol = 2
  ) + 
  theme_bw()+
  theme(strip.text = element_text(size = 7,face = 'italic'),#增大分面标题字体
        strip.background = element_rect(fill = 'white'))+
  xlab(bquote(italic('Rank')))+ylab(bquote(italic('Enrichment Score')))+
  theme(axis.text.x = element_text(size=8,angle = -30,face = 'plain',hjust = 0.5),
        axis.text.y = element_text(size=8,angle = 0,face = 'plain',vjust = 0.5))

image.png

• GseaVis

library(GseaVis)
num1=1
#指定名称：图纸
p1<-gseaNb(object = gsea.re1,
       geneSetID = rownames(g1)[1:num1])
# 只保留曲线
p2<-gseaNb(object =  gsea.re1,
       geneSetID = rownames(g1)[1:num1],
       subPlot = 1)
#曲线保留和热图retain curve and heatmap
p3<-gseaNb(object = gsea.re1,
       geneSetID = rownames(g1)[1:num1],
       subPlot = 2)
# 名称太长截断换行
p4<-gseaNb(object = gsea.re1,
       geneSetID = rownames(g1)[1:num1],
       subPlot = 2,
       termWidth = 30)
#标记里的一些名称：标记里
# add gene in specific pathway
mygene <- c("BIRC5","HMGB3","UBE2T","CCNB2")

# plot
p5<-gseaNb(object = gsea.re1,
       geneSetID = rownames(g1)[1:num1],
       subPlot = 2,
       addGene = mygene)

#基因改变标签颜色和箭头类型：
p6<-gseaNb(object = gsea.re1,
       geneSetID = rownames(g1)[1:num1],
       subPlot = 2,
       addGene = mygene,
       arrowType = 'open',
       geneCol = 'black')

#剩下所有图形：
p7<-gseaNb(object = gsea.re1,
       geneSetID = rownames(g1)[1:num1],
       subPlot = 3,
       addGene = mygene,
       rmSegment = TRUE)

# clsaasic with pvalue
p8<-gseaNb(object = gsea.re1,
       geneSetID = rownames(g1)[1:num1],
       addGene = mygene,
       addPval = T,
       pvalX = 0.75,pvalY = 0.8,
       pCol = 'black',
       pHjust = 0)

image.png

修改主题,自定义颜色
添加统计指标、水平线
改变排列方式
https://mp.weixin.qq.com/s/TzczjJ1KfU3omux9yXH9oA
https://mp.weixin.qq.com/s/z5UrUMAXMxbCE_c4SB4JgA