8+线粒体自噬+铁死亡+分型+实验

今天给同学们分享一篇线 粒体 自噬+铁死亡+分型+实验的生信文章“Gene signature and prediction model of the mitophagy-associated immune microenvironment in renal ischemia-reperfusion injury”，这篇文章于2023年3月28日发表在Front Immunol期刊上，影响因子为8.786。

肾脏缺血再灌注损伤（IRI）是肾移植过程中不可避免的事件。线粒体自噬、铁死亡以及相关的免疫微环境（IME）已被证明在肾脏IRI中起重要作用。然而，与线粒体自噬相关的IME基因在IRI中的作用仍不清楚。本研究旨在基于线粒体自噬相关的IME基因构建IRI预后的预测模型。

1. MRG/FRG表达

作者比较了DBD、DCD和LD的IR和pre-IR样本中MRGs/FRGs的表达，并确定了在这三组中有显著差异表达的六个MRGs和六个FRGs（图1A）。热图显示了不同样本中MRG/FRG的表达情况（图1B-D）。差异表达的MRGs包括FUN14结构域含1（FUNDC1）、外线粒体膜转位酶6（TOMM6）（均下调）、微管相关蛋白1轻链3B（MAP1LC3B）、隔离体1（SQSTM1）、泛素B（UBB）和泛素C（UBC）（均上调）。差异表达的FRGs包括活化转录因子3（ATF3）、Kruppel 2（KLF2）、锌指蛋白36（ZFP36）、细胞周期依赖性激酶抑制剂1A（CDKN1A）、生长分化因子15（GDF15）和丙酮酸脱氢酶激酶（PDK4）（均上调）。作者还通过相关性分析检测了MRG和FRG的表达相关性。相关性矩阵显示在图1E-G中。接下来，作者使用GSE90861和GSE126805数据集验证了12个差异表达的MRGs/FRGs，并发现这12个MRGs/FRGs在这两个数据集中都有差异表达，其表达趋势与作者分析中所发现的一致。

图1 不同ially expressed MRGs/FRGs的热图和相关性分析

2. 不同表达的MRGs/FRGs的PPI、miRNA、TF和小分子化合物相互作用网络

作者构建了12个差异表达的MRGs/FRGs的PPI网络，发现ZFP36、UBC、GDF15、MAP1LC3B、CDKN1A、SQSTM1、TOMM6、UBB、ATF3、KLF2、PDK4和FUNC1分别与187、186、119、116、104、75、59、59、43、12、12和2（ZNF71和MAZ）个转录因子（TFs）相关联。miRNA相互作用分析显示，CDKN1A、KLF2、ZFP36、UBC、UBB、MAP1LC3B、SQSTM1、ATF3、GDF15和PDK4分别与331、107、53、49、42、42、27、24、23和6（hsa-mir-16-5p、hsa-mir-26b-5p、hsa-mir-103a-3p、hsa-mir-182-5p、hsa-mir-122-5p和hsa-mir-335-5p）个miRNA相关联。此外，小分子化合物相互作用分析显示，CDKN1A、ATF3、GDF15、SQSTM1、MAP1LC3B、ZFP36、PDK4、KLF2、UBC、UBB、FUNDC1和TOMM6分别与618、204、202、166、95、72、56、45、29、22、6（对乙酰氨基酚、儿茶素、环孢霉素、葡萄籽原花青素、K7174和四氯二苯并二噻吩）个，以及7（黄曲霉毒素B1、砷、氯硝烯、硫酸铜、环孢霉素、K7174和丙戊酸）个小分子化合物相关联。

3. 分子亚型划分

NMF亚型分析显示，聚类系数在rank=2时开始下降，表明最佳亚型数量为2（图2A）。亚型的热图如图2B所示。主成分分析显示，样本可以通过这两个亚型清晰地区分开来（图2C）。亚型与预后的相关分析表明，亚型之间的生存时间差异显著，亚型2患者的预后优于亚型1患者（图2D）。免疫细胞浸润分析显示，亚型1患者的静息树突状细胞、M2巨噬细胞、静息NK细胞、CD8+ T细胞和调节性T细胞（Tregs）浸润显著增加（P < 0.01），而亚型2患者的M1巨噬细胞、中性粒细胞、活化记忆CD4+ T细胞和γδ T细胞浸润显著增加（P < 0.05）（图2E）。MRGs/FRGs的表达，即FUNDC1、MAP1LC3B、SQSTM1、UBB、ATF3、KLF2、ZFP36、CDKN1A和PDK4，在两个亚型之间存在显著差异（P < 0.05）（图2F）。

图2 分子亚型分型

4. 预后标志物选择、风险评分计算和评估

作者使用LASSO回归选择了七个MRGs/FRGs（FUNDC1、SQSTM1、UBB、UBC、KLF2、CDKN1A和GDF15）作为预后标志物。ROC曲线的AUC为0.73，表明具有良好的预测能力。高/低表达组中七个候选基因的生存曲线如图S4D-J所示。根据LASSO回归确定的候选预后标志物的系数计算出风险评分（RS）。

RS预测生存的ROC曲线显示出良好的预测能力（图3A）。使用maxstat，作者确定了预测接受肾移植患者生存的最佳RS截断值为-25.0716。然后，作者根据这个截断值将接受肾移植的患者分为高RS组和低RS组，并移除没有生存信息的患者。高RS组的患者预后明显较差，与低RS组相比（P < 0.0001）（图3B）。

图3 风险评分和评估

此外，作者比较了高RS组和低RS组之间的免疫细胞浸润程度（图3C）。作者的分析显示，高RS组中B细胞、中性粒细胞、T细胞和M1巨噬细胞的浸润程度更高（P < 0.01），而低RS组中记忆B细胞、树突状细胞（DCs）、M2巨噬细胞、静止NK细胞、调节性T细胞（Tregs）和T细胞的浸润程度更高（P < 0.01）。

5. RS组中的差异基因表达和富集分析

作者对这些差异表达基因进行了富集分析。KEGG分析显示，这些差异表达基因富集在金黄色葡萄球菌感染、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用、趋化因子信号通路、蛋白质消化和吸收以及百日咳等方面。此外，GO分析显示，差异表达基因与生物过程（BP）相关，如体液免疫应答、白细胞介导的免疫、基于免疫球蛋白超家族结构域的体液免疫应答、淋巴细胞介导的免疫以及免疫应答的激活；与分子功能（MF）相关，如抗原结合、CXCR趋化因子受体结合、糖胺聚糖结合和肝素结合；以及与细胞组分（CC）相关，如细胞外侧、血液微粒、含胶原的细胞外基质、胶原三聚体和分泌颗粒腔。

6. 低氧导致HK2细胞受损

细胞在常氧组和低氧组中的存活率通过流式细胞术进行测量。作者的结果表明，在低氧组中，坏死和凋亡的HK2细胞数量远高于常氧组（图4A），同时伴随着细胞内ROS水平的增加。作者还发现，在低氧后，线粒体膜发生了去极化，这表明低氧可能会损害线粒体功能（图4B）。

图4 在缺氧环境下，HK2细胞会引发铁死亡，并伴随着炎症因子的分泌

接下来，作者通过收集培养上清液来检查不同条件下HK2细胞的炎症反应。缺氧上调了HK2细胞中炎症介质的表达（图4C）。此外，在缺氧后，HK2细胞培养上清液中的铁死亡相关标志物的表达也增加了，这表明缺氧加剧了HK2细胞的铁死亡（图4D）。总的来说，这些发现表明缺氧导致肾小管上皮细胞损伤，同时增加了炎症介质的表达、线粒体自噬和铁死亡。

7. IRI导致小鼠肾功能受损

作者比较了假手术组和缺血再灌注组小鼠的肾功能，发现肾缺血再灌注损伤导致肾功能受损（图5A）。缺血再灌注引起严重的肾小管损伤，表现为肾小管上皮细胞坏死和脱落（图5B）。TUNEL染色结果也表明缺血再灌注引起严重的肾损伤。接下来，作者发现炎症介质在模型组中明显过表达，与假手术组相比（图S8）。此外，质谱流式细胞术揭示肾缺血再灌注显著增加了免疫细胞对肾脏的浸润（图5C）。模型组与假手术组相比，铁死亡标志物的水平差异显著（P < 0.05）。此外，作者还观察了肾组织中FRG和MRG的表达，表明缺血再灌注可以上调FRG和MRG的表达诱导线粒体自噬（图5D）。透射电子显微镜证实肾缺血再灌注导致线粒体萎缩，线粒体嵴消失减少，线粒体膜密度增加，自噬体丰富（图5E）。

图5 肾脏缺血再灌注损伤会导致肾功能不全和小鼠中的损伤

总结

总之，线粒体在应激条件下（如缺血再灌注损伤）极易受损，导致功能紊乱。线粒体分裂和融合之间的动力学调控机制已在临床人体样本、HK2细胞和急性肾脏缺血再灌注损伤的小鼠模型中得到证明。维持线粒体动力学的稳态可能是缓解急性缺血再灌注损伤的新研究方向，也可能成为药物作用的新靶点。然而，还需要进一步的研究和验证才能在临床实施中应用。