ORF的前世今生

作者：Snail
审稿：童蒙
编辑：angelica

引言

初识ORF被其搞得七荤八素，希望这篇文章可以带各位小主揭开其神秘面纱。
我们围绕三个终极的哲学问题展开：ORF是什么，从哪里来，到哪里去……

自报家门

ORF，Open Reading Frame，称为开放阅读框。

DNA通过转录合成mRNA。在mRNA中，遗传密码以3个核苷酸为单位阅读，每一组可编码一个氨基酸或作为翻译的终止信号，即每三个核苷酸序列成为一个密码子（codon）。

根据起始点的不同，每条链可能有三种不同的方式将核苷酸翻译成蛋白质，其中以起始密码子（AUG）开始，延伸至终止密码子（UGA、UAA、UAG），可以翻译成蛋白质的读框称为开放阅读框（ORF）。一般情况，任何一段碱基序列只有一个读框是开放的，其他的读框则会因为频繁出现终止密码子而被阻断。

那么，CDS和ORF之间又是怎样的关系呢？

CDS（coding sequence）是编码蛋白产物的一段序列，是事实存在的编码区；而ORF是理论上的编码区，因此CDS一定是一个ORF，但ORF不一定均为CDS。

寻踪觅迹

先来划重点！！！

ORFfinder是NCBI提供的一款在线点点点的ORF查找器。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/

TransDecoder是一款专门针对转录组序列预测ORF的工具。

https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases

ORFfinder

1 输入gi或Accession编号，亦或直接输入序列的fa文件

2 选择相关参数：ORF长度的阈值；遗传密码子的格式；使用的起始密码子

3 提交后可得到预测的ORF序列信息以及推测的氨基酸序列信息

4 得到氨基酸序列后可直接在界面进行SmartBLAST（简洁强化版blastp）或BLAST，对预测出的ORF进行功能注释

TransDecoder

1 提取最长的开放阅读框

TransDecoder.LongOrfs -t transcripts.fa -m 100 -G universal
默认情况下，-m默认100，即识别氨基酸个数大于100对应的ORF；-G默认universal，即使用标准格式的密码子。

2 通过blast或Pfam检索已知蛋白的同源序列，保留对应的ORF（该步骤可选）

blastp蛋白数据库检索，可使用Swissprot （http://www.uniprot.org/[Swissprot）数据库，速度较快；或者 Uniref90 速度慢但较为全面。

blastp -query transdecoder_dir/longest_orfs.pep -db uniprot_sprot.fasta -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_threads 10 > blastp.outfmt6
Pfam蛋白质结构域检索，需预先安装hmmer3和Pfam数据库。

hmmscan --cpu 8 --domtblout pfam.domtblout Pfam-A.hmm transdecoder_dir/longest_orfs.pep

3 预测可能的编码区

TransDecoder.Predict -t transcripts.fa -retain_blastp_hits blastp.outfmt6 –retain_pfam_hits pfam.domtblout
-retain_blastp_hits / –retain_pfam_hits 参数可保留步骤二中的ORF。

4 结果可视化，可在GenomeView或IGV查看候选的ORF

java -jar $GENOMEVIEW/genomeview.jar transcripts.fa ransdecoder.bed

锁定编码基因

在获得一段未知的序列后，我们就可以分析其读框是阻断的还是开放的，一般情况下ORF不会太长，如果不被翻译成蛋白质，则不存在阻止终止密码子聚集的选择压力。证明长序列为ORF是确定该读框能被翻译成蛋白质的首要证据，而没有蛋白质被鉴定出的读框称为不明读框（unidentified reading frame，URF）。因此，可通过ORF的识别来判定未知序列是否编码蛋白后，根据功能注释信息、推断未知序列的结构及功能。

参考
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki
Lewin,B编著; 余龙, 江松敏, 赵寿元主译. 基因VIII. 北京: 科学出版社, 2005: 02.