图位克隆的方法、过程及优缺点

举例说明图位克隆的方法、过程及优缺点

该方法分离抗病基因首先要构建一个覆盖目的基因区域的精密分子标记遗传连锁图，以此为基础进一步制作覆盖目标基因区域的物理图谱，获得包含目的基因的克隆。从理论上讲，任何一个能定位的基因都可用图位克隆法分离，且该方法已被广泛采用并证明行之有效。

用图位克隆法克隆目的基因，有三个步骤：第一步是目的基因的染色体定位并找到与目的基因紧密连锁的分子标记。一般说来，第一步的完成并不困难，但要获得一张精密的该区段分子标记连锁图，往往需要一个较大的群体，将基因定位于一个非常狭小的区段内。这一步工作做的越细，后面的工作越容易。例如：水稻抗稻瘟病基因Pib的克隆（Wang et al. 1999），仅感病单株就用了3305株。利用这些单株将基因定位于0.06cM的区段内，如此狭窄的区段，可直接利用小片段的Cosmid文库覆盖这一区域，大大缩短了后续工作的时间，减少了工作量。此外，若所用的物种在该区段已有大量的分子标记定位或一张高密度连锁图（如拟南芥、水稻），会大大加快工作进度。第二步用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选大片段基因组文库（YAC或BAC文库），以阳性克隆末端及其亚克隆进行染色体步查，构建覆盖目的基因区域的物理图谱，获得含目的基因的克隆；这一步对第一步的工作和所用物种依赖性极大。第三步候选基因的鉴定及其结构和生物学功能的分析。基因鉴定工作，一般有两种方法－转化互补法和突变体的利用法。应用较多的是前者，主要是将所分离的基因转入非抗病的品种中，鉴定转化植株是否能抗同一生理小种，若能，则说明已分离到目的基因（Bent et al.1994，Martin et al. 1993，Song et al. 1995，Yoshimura et al. 1998），一般需要花费较多的时间。后者需要较多的待分离基因的突变体，只要鉴定出所分离的基因在所有的突变体中也发生了突变，就可认为所分离的基因是目的基因（Buschges et al. 1997）。

图位克隆法一般仅适用于小基因组植物。大基因组的物种，由于物理距离和遗传距离之比很大，不利于染色体的步移。而第一步若能将基因限定于一个非常狭小的区域，将极大地减少物理图谱构建的工作量，并且有利于进一步用小片段的基因组文库覆盖该区域，迅速确定候选基因。要知道，从一个长几百或上百kb的YAC或BAC克隆中找到目标基因，仍有一段漫长路要走。对于克隆那些结构性质一无所知的基因，有时一个YAC或BAC含有多个开放读码框（ORF），所有的这些ORF都做互补实验，工作量是十分巨大的。这样，若第一步的工作做细，就可将目标基因限定在一个或少数几个ORF上，就能迅速获得基因。用图位克隆法克隆基因是非常耗时、费力的工作，并需要足够经济支持。即使对水稻这样的小基因组作物（平均1cM相当于260 Kb; Wu & Tankey, 1993），已构建了多张高密度分子标记连锁图（Causse et al., 1994, Harushima Y et al., 1998）和多个大片段基因组文库。要克隆一个基因，工作量仍是惊人的。

从图位克隆法克隆基因的过程，可看出此法的局限性：
（1）仅适合于小基因组物种；
（2）工作量巨大；
（3）目的基因区域的精细遗传图谱的完成是图位克隆的前提；
（4）必须构建多种文库（基因组文库、cDNA文库等）；
（5）必须有连锁非常紧密的分子标记；
（6）目的基因所控制的性状必须容易识别，受环境因素影响小。