RNA-seq摸索：3.基因表达水平分析→featureCounts计量→差异表达分析及可视化

参考这篇：
我觉得学RNA-seq必看的文献！！
这篇写的特别好：RNAseq-workflow
本科生搞定RNA-seq上游数据分析
RNA-seq一般流程

1. 下载gtf基因组注释文件

ftp://ftp.ensembl.org/pub/current_gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.99.gtf.gz
ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_29/gencode.v29.annotation.gtf.gz

2. 使用featureCounts进行alignment-based的定量

gtf="路径/Homo_sapiens.GRCh38.99.gtf.gz" 
featureCounts -T 5 -p -t exon -g gene_id  -a $gtf -o  all.id.txt  *.bam
cat all.id.txt | cut -f1,7- > counts.txt  #去除多余信息，保存表达矩阵为counts.txt

3. 差异表达分析

在R中

3.1 基因表达量的标准化方法及可视化

以下资料来源于：counts值，RPM,RPKM,FPKM,TPM的异同

标准化的主要目的是去除测序数据的技术偏差：测序深度和基因长度。

测序深度：同一条件下，测序深度越深，基因表达的read读数越多。

基因长度：同一条件下，不同的基因长度产生不对等的read读数，基因越长，该基因的read读数越高。

Counts值

对给定的基因组参考区域，计算比对上的read数，又称为raw count（RC）。

计数结果的差异的影响因素：落在参考区域上下限的read是否需要被统计，按照什么样的标准进行统计。

RPM (Reads per million mapped reads)

RPM

RPM方法：10^6标准化了测序深度的影响，但没有考虑转录本的长度的影响。

RPM适合于产生的read读数不受基因长度影响的测序方法，比如miRNA-seq测序，miRNA的长度一般在20-24个碱基之间。

RPKM/FPKM (Reads/Fragments per kilo base per million mapped reads)

RPKM/FPKM

RPKM/FPKM方法：10^3 标准化了基因长度的影响，10^6标准化了测序深度的影响。

FPKM方法与RPKM类似，主要针对双末端RNA-seq实验的转录本定量。在双末端RNA-seq实验中，有左右两个对应的read来自相同的DNA片段。在进行双末端read进行比对时，来自同一DNA片段的高质量的一对或单个read可以定位到参考序列上。为避免混淆或多次计数，统计一对或单个read比对上的参考序列片段（Fragment），来计算FPKM，计算方法同RPKM。

RPKM/FPKM与RPM的区别：考虑了基因长度对read读数的影响。
RPKM与FPKM的区别：RPKM值适用于单末端RNA-seq实验数据，FPKM适用于双末端RNA-seq测序数据。

RPKM/FPKM适用于基因长度波动较大的测序方法，如lncRNA-seq测序，lncRNA的长度在200-100000碱基不等。

TPM (Transcript per million)

TPM

TPM的计算方法也同RPKM/FPKM类似，首先使用式2计算每个基因的表达值，去除基因长度的影响。随后计算每个基因的表达量的百分比，最后再乘以10^6，TPM可以看作是RPKM/FPKM值的百分比。

TPM值就是RPKM的百分比

相当于重新标准化的文库，保证每个样本中所有TPM的总和是相同的。

TPM与RPKM/FPKM的区别：从计算公式来说，唯一的不同是计算操作的顺序，TPM是先去除了基因长度的影响，而RPKM/FPKM是先去除测序深度的影响，TPM实际上改进了RPKM/FPKM方法在跨样品间定量的不准确性。
TPM的使用范围与RPKM/FPKM相同。

总结

raw count作为原始的read计数矩阵是一个绝对值，而绝对值的特点是规模不同（基因长度、测序深度），不可以比较。进行这些基因标准化方法的目的是将count矩阵转变为相对值，去除技术偏差的影响，使后续的差异分析具有统计学的意义。

3.2 差异表达分析及可视化

limma/voom，edgeR，DESeq2，转录组差异分析的三大R包!