不同强度的超声处理后生菜（Lactuca sativa L.）上荧光假单胞菌生物膜的分子和蛋白质组反应

一、文献简介

1.1 Title：Molecular and proteomic response of Pseudomonas fluorescens biofilm cultured on lettuce (Lactuca sativa L.) after ultrasound treatment at different intensity levels

1.2 作者：Hang Yu

1.3 文献类型：期刊

1.4 期刊：Food Microbiology

1.5 分区/影响因子：Q1/5.3

1.6 机构：Jiangnan University

1.7 Abstract:在农产品加工过程中，超声波处理被广泛用于蔬菜的表面清洁。本研究调查了不同强度的超声波处理后莴苣上荧光假单胞菌生物膜的分子和蛋白质组反应。结果表明，在超声处理强度高于 21.06 W/cm2 时，生物膜被有效清除。然而，在强度低于 18.42 W/cm2 时，荧光团菌受到超声波的刺激，从而促进了细菌的生长、胞外蛋白酶活性、胞外多糖分泌（EPS）以及作为法定量感应信号分子的酰基高丝氨酸内酯（AHLs）的合成。在超声处理后，生物膜相关基因、应激反应和双法定人数感应系统的表达均上调。蛋白质组分析表明，超声激活了鞭毛系统中的蛋白质，导致细菌倾向发生变化；同时，双组分系统中的大量蛋白质开始受到调控。ABC 转运体加速了细胞膜内外物质的膜转运，平衡了细胞膜的通透性条件。此外，与 DNA 修复相关的蛋白质表达也出现了上调，这表明细菌在接触超声波后会修复受损的 DNA。

二、Materrials and methods

2.1 微生物、培养条件和生菜生物膜的制备：荧光假单胞菌28◦C24h，生菜切成3*3蒸馏水洗后浸泡在clo2溶液2min，再用蒸馏水洗后浸泡在荧光假单胞菌5min，风干后在15度孵育48h得到生物膜。

2.2 超声处理条件：超声频率20khz，输出密度分别是15.79，18.42, 21.06, 23.68和26.32 W/cm2

2.3 生物膜含量、EPS 含量和细胞外蛋白酶活性的测定
生物膜测定：用 0.2% 水晶紫溶液对生物膜染色 15 分钟，然后测定波长为 595 nm的吸光度值。
超声处理的细菌悬浮液6000g 30min下离心，2ml上清液与6ml乙醇混合，沉淀物用6ml去离子水溶解。用苯酚硫酸法选择葡萄糖为标准；
胞外蛋白酶活性：2ml上清液与6mltris-hcl混合，40度5min预热酶，1ml1%酪蛋白溶液添加到样本40度孵育10min，2ml的三氯乙烯氨酸溶液加入保持20min，再离心8000r/min15min，最后5ml碳酸钠和1ml福林溶液与1ml上清混合在40度下保持20min，680nm下测定吸光度

2.4 抽动、成群和游动的运动能力测定

抽动、成群和游动的运动能力测定：在平板凝固前，在平板中心接种 5 μl 未处理或超声处理过的荧光虫溶液。然后将平板在 28 ◦C 下培养 24 小时，再测定荧光菌的运动能力。

2.5 激光扫描共聚焦显微镜和扫描电镜分析：采用活/死 BacLight 细菌活力试剂盒，荧光强度是在 SYTO 9 的激发/发射波长为 485/530 纳米和 PI 的激发/发射波长为 485/630 纳米时测定的。CLSM成像获得细菌的特征值包括平均厚度，粗糙度，生物量。SEM：荧光假单胞菌生物膜用2.5%戊二醇固定在4度玻璃片4h，用蒸馏水冲洗两次，再用30%50%70%90%和100%乙醇脱水15min。

2.6 AHLs信号分子的描述与定量：将 50 毫升上清液和 50 毫升含 0.5%甲酸的乙酸乙酯混合，以提取 AHL。

2.7 RNA提取及rt-qpcr分析：rpoS, flgA, algD, aprX, lapA, gacA, gasS, pcoI, and pcoR

2.8 蛋白取样测序和分析

补充：

菌株生物膜形成能力检测1：

冻存菌株在血平板上复苏，培养16～18 h后用无菌棉签挑取3个单克隆菌落制备0.5麦氏浊度菌悬液，将200 μL LB液体培养基和20 μL 0.5麦氏浊度的菌悬液(阴性对照加入20 μL LB液体培养基，阳性对照为ATCC700603)接种于96孔细胞培养板中，96孔细胞培养板周围加入生理盐水保持湿度。将培养板置于35 ℃含5%CO2的培养箱中静置培养30 h; 弃去LB液体培养基，并用灭菌双蒸水清洗3次，弃去游离细菌，随后加入甲醇固定10 min; 每孔加入300 μL 1%结晶紫染液染色2 min, 灭菌双蒸水清洗3次去除未结合染液；控干水分后每孔加入200 μL 95%乙醇充分溶解结晶紫染液，读取570 nm处吸光度值[1]。以吸光度值(阴性对照的平均吸光度值+3×标准差值)为临界值，大于该吸光度值则判定为形成生物膜。

生物被膜量的测定2:

取每组储藏的生菜3片于无菌烧杯中，小心地用无菌生理盐水洗涤生菜表面以去除杂质和浮游菌。向烧杯内加入2 mL的0.1%结晶紫染液，染色15 min。随后，用2 mL的33%乙酸，静置15 min溶解生物被膜。测量595 nm处的吸光度值。

生菜表面生物被膜表观形态的观察3:

将储藏的生菜取一片放在黑色背景板上，拍照记录生菜叶片直观品质变化。同时使用场发射扫描电子显微镜（FESEM）在3.00 kV电压下，以10000倍放大率观察超声后球心生菜表面生物被膜。

运动性方案2:

基础运动培养基的配制：LB培养基中添加0.25%的琼脂粉，配置成基础运动培养基，配置好的培养基121 °C高压灭菌15 min，待其冷却到60 °C左右，在超净工作台中倒入平板，25 °C过夜放置后使用。 运动性试验：5.3.2中的菌沉淀用0.85%生理盐水重悬，用接种针分别沾取后于运动培养基中央穿刺， 25 °C培养24 h后取出量取运动环直径。

三、Results and discussion

超声处理0, 15.79, 18.42, 21.06, 23.68, and 26.32 W/cm2 from 0 to 24h荧光假单胞菌生长曲线

结果：0-4h生长慢，4-20h生长速率达到最高，20h时达到稳定相；

低超声处理15.79和18.42w/cm2，在前4h培养中，荧光假单胞菌可数细胞显著高于对照组；

超声处理高于21.06w/cm2荧光假单胞菌细胞密度显著高于对照；

超声处理0, 15.79, 18.42, 21.06, 23.68, and 26.32 W/cm2 from 0 to 24h荧光假单胞菌生物膜的生长曲线

结果：荧光假单胞菌生物膜在12-48h培养时形成，48h后生物膜达到成熟阶段；

生物膜的种群密度在超声处理15.79和18.42w/cm2显著高于对照组；

超过21.06w/cm2，生物膜形成受到抑制生物膜种群密度显著低于对照组；

未处理和超声处理15.79, 18.42, 21.06, 23.68, and 26.32 W/cm2后荧光假单胞菌（A)生物膜内容物（B）EPS（C）胞外蛋白酶（D）抽搐、（E）成群和（F）游动的移动性的相对比率以及相应的（G)扩散直径图

结果；低超声处理15.79和18.42w/cm2胞外蛋白酶活性从7.08%增加到11.21%；超声处理增加到23.68和26.32w/cm2 胞外蛋白酶活性显著降低了12.58%和23.50%；

超声强度增加到15.79和18.42w/cm2，在twiching、swarming和swimming之间没有显著差异，与对照组相比。超声处理在21.06，23.68、26.32w/cm2，三者的移动性衰减。这一结果与生物膜形成、EPS分离，胞外蛋白酶活性一致。

超声处理后的荧光假单胞菌平均厚度，粗糙度和生物量

结果：低强度超声处理显著增加生物膜的平均厚度和生物量。

超声处理强度增加时，生物膜的厚度和生物量显著降低，粗糙度显著增加。

超声处理后的荧光单胞菌生物膜的激光扫描共聚焦和扫描电镜成像

CLSM结果；未超声处理生物膜表面保持光滑发射绿色荧光；超声处理15.79，细菌分离较多的胞外基质，生物膜体积变大；

在未处理和18.42超声处理之间生物膜厚度没有显著差异，部分区域显示红色荧光，与此同时，生物膜表面变得粗糙说明在这18.42个强度下导致细菌死亡。

超声强度的增加到26.32，观察到大部分红色荧光，生物膜内含物的形成是62.35%少于对照组。

SEM结果：未处理的荧光假单胞菌聚集保持生物膜的结构，以及完整性；超声强度超过21.06生物膜结构大量损害，内部细菌体数量显著降低，减少了生物膜的堆积结构.

超声处理后荧光假单胞菌生物膜AHL信号分子的变化

结果：与对照相比，超声15.79处理后荧光假单胞菌产生的AHLs信号分子（C4-HSL\C8-HSL\C10-HSL\C12-HSL)分别增加了11.4%26.2%16.7%18.7%。

超声处理后的转录组变化

结果：超声处理15.79和18.42时9个基因都上调；与对照相比15.79:相关基因从1.13增加到2.54，18.42:相关基因从1.2增加到3.03；

超声处理超过21.06相关基因表达受到抑制；rpos、xtha、uvrc在最初受到压力后活化；

超声处理后的荧光假单胞菌相应转录组机制

（未）超声处理后的荧光假单胞菌蛋白水平变化的聚类分析图

结果：上调倍数大于 1.2 或下调倍数小于 0.83（p < 0.05）的差异表达蛋白被确定为差异表达蛋白。

（未）超声处理的差异表达蛋白质的聚类分析图谱

结果：164个蛋白上调，19个蛋白下调.

补充：火山图解读

1、每个点代表一个检测到的 基因；

2、横轴和纵轴用于固定点在空间的位置；

3、一般横轴是 Log2 (fold change) ，点越偏离中心，表示差异倍数越大；

4、纵轴是 -Log 10 (P-value) ，点越靠图的顶部表示差异越显著；

5、点的大小和颜色也可以表示更多的属性，如下图中点的颜色标记其对应的基因是 上调, 下调 还是 无差异 ；

6、大小也可用于展示基因表达的平均丰度，一般我们关注表达水平较高且差异较大的基因用于后续的分析和验证.

所有被确定的蛋白通过GO进行功能分类

结果：在生物过程中与localization相关的蛋白比例最高，接着是transport和transmembrane transport；

在细胞组成的分类中，蛋白最高比例表现在membrane，接着是the integral component of the membrane；

在分子功能中，蛋白联系最紧密的事receptor activity接着是signal transducer activity；

KEGG通路分析对蛋白进行功能分类；是日本京都Kanehisa Laboratories根据文献证据手工整理的一个庞大数据库（包括信号通路、基因、疾病、药物等等）。

KEGG富集结果显示，差异表达的的蛋白质共涉及到17个通路，其中3个通路显著变化包括the flagella assembly pathway,the two-component system pathway和the transport protein pathwayABC;

COG分类对蛋白进行功能分类

结果：COG分类主要涉及amino acid transport and metabolism, transcription, general function prediction, signal transduction mechanisms, translation, ribosome structure and biosynthesis, cell wall/membrane/shell biosynthesis, lipid transport and metabolism, energy production and conversion, coenzyme transport and metabolism, and carbohydrate transport and metabolism.

四、Conclusions

本研究调查了不同强度的超声波处理后，莴苣上培养的荧光团菌生物膜的分子和蛋白质组反应。结果表明，超声波的强度在杀菌效果中起着关键作用。当超声波强度超过 21.06 W/cm2 时，超声波产生的剪切力、冲击波和高温高压环境在很大程度上破坏了生物膜结构，进而灭活了细菌细胞。而强度相对较低的超声波处理（<18.42 W/cm2）只破坏了生物膜的表层，导致细菌释放到环境中。此外，受到超声波刺激的荧光团杆菌对超声波应激反应迅速，随后抵抗了来自外部环境的应激，这促进了细菌的生长、生物膜的形成以及荧光团杆菌产生的 AHL 信号分子的合成。生物膜相关基因（flgA、algD、aprX 和 lapA）、应激反应基因（rpoS、xthA 和 uvrC）以及双法定量感应系统基因（pcoI/pcoR 和 gacA/gacS）的表达量都因超声反应而显著增加。蛋白质组分析表明，超声处理导致荧光菌中 183 种蛋白质的表达出现显著差异，包括 164 种蛋白质的上调和 19 种蛋白质的下调。鞭毛系统、双组分系统、ABC转运体和DNA修复等蛋白的表达均显著上调。这些现象表明，在强度相对较低的超声处理后，细菌会启动应激反应和损伤修复。