2020年发表在cell上的一篇IBD体细胞突变的文章，来自sanger 研究所。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.036
炎性肠病（IBD）是一种慢性炎性疾病。研究人员对来自46个IBD患者的446个结肠隐窝进行了全基因组测序，并将其与他们以前发表的有关正常结肠突变情况的41个非IBD对照的412个隐窝进行了比较。
文章发现受炎症性肠病影响的结肠上皮细胞的平均突变率是健康结肠的2.4倍。也发现了17种突变过程中的Signature。与正常结肠相反，在正常结肠中，隐窝范围以外的克隆扩展很少，但在IBD中观察到了广泛的毫米级克隆扩增。并发现了在IBD中ARID1A，IL17等免疫相关基因突变的正向选择的独特机制。
本研究使用的446个结肠隐窝是取自28个溃疡性结肠炎和18个克罗恩病的病人。包括取自从未，以前或者取样时有炎症的不同活检样本，进行了WGS的测序，平均深度在18.2左右，可以测出碱基替代，插入缺失，拷贝数变化，染色体或染色体臂的非整倍性等信息。为了评估IBD与正常结肠中mutation burden的差异，研究使用他们去年发表在nature上正常结肠上皮的文章作为control。使用LMM模型去评估年龄，疾病持续时间，取样位置作为独立因素计算与mutation burden的关系。在计算后发现，IBD每个隐窝在得病期间平均每年增加55个碱基替换突变，而结肠上皮在正常情况下是每年40个碱基替换，说明在IBD的影响下，突变速率提升到了2.4倍。也对indel进行了拟合，IBD是平均每年每个隐窝发生6.8个indel，结肠上皮正常情况下是一年1个indel。在图B中可以看到有几个病人的突变数目远高于拟合区间，这可能和他们吸烟有关，但是在计算上，吸烟状态对IBD的影响，并没有明显差异。
这些不同的突变构成了很多突变Signature。研究人员在IBD和正常对照中共提取出了12个SBS的单碱基替代的Signature和5个indel的Signature。对比IBD和control，发现80%的mutation burden的增加是由可以在正常结肠中常见的Signature引起的，包括SBS Signature1，5，18，和indel Signature1，2。在拟合估计后，可以看到这些Signature在年龄和患病时长影响下平均每年产生的突变增加数量。
然后文章将Signature的图谱展示出来，分别是克罗恩病，溃疡性结肠炎和正常上皮对照的SBS和indel Signature。上一张图提到了80%的突变增加来自正常结肠上皮中常见的Signature，另外20%的突变增加源自一些稀少的突变过程和治疗等。举例来说，在96个隐窝中发现了超过150个嘌呤相关的突变，这7个人中有5个人接受过嘌呤类药物的治疗。但是嘌呤相关的突变数量和他们使用嘌呤类药物的时间并没有显著相关。在B中列出了两位经过嘌呤类药物治疗的病人的各个隐窝突变进化关系，并以Signature进行填充。其中左边这位10号病人服用10年的咪唑硫嘌呤类药物，并没有明显的SBS32嘌呤相关的Signature，但是右边这位17号病人，服用过两种不同的嘌呤类药物各两周，且具有明显的不良反应，能在他不同的隐窝中看到嘌呤相关的SBS32。还发现在一位经历过铂类药物治疗的病人出现了SBS35，铂类药物治疗相关的Signature，他只接收了三个疗程的治疗，但是却出现了430个相关突变，约等于10年可以产生的突变数量。
然后文章计算了IBD与正常结肠上皮的结构变异。统计得到，IBD患者和正常对照的CNV和逆转座克隆大部分还是较低的，但是也有极个别显著变化的CNV和逆转座突变出现在IBD患者中。研究还发现携带非整倍体的IBD隐窝的比例高于对照组。但是，这是由携带非整倍性的大型克隆驱动的，非整倍体发生的数量与疾病持续时间没有显着相关性。这些CNV，逆转座突变率，非整倍体突变比例都和较高的单碱基替换burden相关，CNV和逆转座突变还和indel的mutation burden相关。
结肠隐窝通过隐窝裂变的过程分开，隐窝在基部分叉，分支以类似拉链的方式向内腔延伸。该过程在正常结肠中相对罕见，其中每个隐窝平均每27年裂变一次。与正常结肠相比，研究在IBD患者中发现了更大的克隆扩增，并在较晚的时间发生了大量隐窝裂变。在2-3毫米的内窥镜活检范围中，研究人员发现了几个单独的克隆，他们评估克隆范围大小的能力受到了内窥镜活检范围的限制，所以之后对三个病人又进行了更广泛的取样。每位患者获得9份活检，来自3cm×3cm网格的范围，一共分离出187个隐窝并对每个隐窝进行了全外显子组测序，然后构建了这三个人的突变进化树。
尽管活检中的克隆扩增很常见，但研究发现仅其中一名患者的克隆在相邻的活检之间进行了延伸，就是这位62号病人，可以看出同一树枝下有来自不同的活检样本。已有大量研究证据表明，广泛的克隆扩增会导致IBD的发育异常并最终导致结直肠癌。因为通常溃疡相关的结肠癌会有很多的病变，是由几厘米大范围扩增的癌前病变生长而来的。总之，IBD影响的区域不是有单一克隆支配的，而是拥有比正常结肠上皮更大范围的克隆扩增。
针对这个结论，文章还举了三个病人的例子。首先是第一列是35号病人66岁，具有25年溃疡性肠炎患病史，下面病理切片中的三个隐窝在上图中用橙色背景标出，蓝色和橙色的分支都是来自曾经感染过炎症并且扩增范围在数毫米范围内的隐窝。第二列是36号，具有27年溃疡性肠炎病史的61岁病人,同样紫色和黄色的分支扩增范围在数毫米内。第三个病人是克罗恩病，他的一个切片中包含了两个扩增。
在反复炎症和缓解过程中，IBD会通过创造出一个有利于突变克隆扩增的环境。为了鉴定出可能赋予细胞选择性优势的突变，研究先选择了Cancer Genome Atlas的10个经典突变热点基因，KRAS，TP53，FBXW7 等，还有一些研究人员发现的其他错义突变和一些推测可能是驱动突变的基因，比如ATM等基因，先统计了这些基因的突变情况。并计算了这些肿瘤驱动基因和碱基替换缺失扩增增加的数量显著相关。
然后研究人员为了寻找正向选择的基因，采用了dn/ds的算法，也就是计算非同义突变和同义突变的比率，dn比ds的比率明显不等于1的被认为是基因是被选择的。这个计算结果选出了四个基因，ARID1A, FBXW7,
PIGR, 和ZC3H12A被认为是在IBD结肠中是被正向选择的。简单理解，其实就是计算出了IBD的四个driver基因。其中ARID1A和FBXW7是已经确定的抑癌基因，并在结肠癌中具有相似的低频突变率。
另外，在某些情况下，能够在同一患者的不同隐窝中发现了同一基因中不同的杂合突变。例如，在一名患有溃疡性结肠炎的患者中，从结肠的右侧，横向和左侧的四个活检组织中发现了四个不同的PIGR突变。研究还比较了在正常结肠那篇文章中用dn/ds算法计算出的正向选择的基因，AXIN2 or STAG2，并没有在IBD中发现有意义，在正常结肠上皮中也没发现IBD中得出的PIGR or ZC3H12A 这两个正向选择的基因。同时也没发现在克罗恩病和溃疡性结肠炎中有什么明显差异的driver 基因，表明在两种疾病的粘膜组织中，具有相似的选择压力。
然后又进行了通路水平的dnds计算，在15个基因集中寻找错义和截短变异，这15个pathway都是在结肠癌或者IBD病变相关的基因集，图中展示的是截短突变在这些pathway中的dN/dS的结果。标星的代表q<0.05
研究观察到与结肠癌相关的基因的截断突变富集IBD是control的6.5倍，而在泛癌分析选择的基因集中富集了1.9倍。而且，pathway水平的dNdS结果还显示出IL-17信号途径中的截短突变的含量增加了4.0倍，在Toll样受体（TLR）级联反应中富集了3.3倍，这几种pathway的富集，在来自UC和CD的隐窝中均发生突变。
总结一下文章，文章主要通过分析mutation burden，Signature，隐窝的克隆与突变进化，还有通过dn/ds算法筛选正向选择性的基因等方面对IBD影响下的结肠上皮体细胞突变进行了较为完整的分析，发现了IBD的突变速度比正常结肠上皮快，克隆扩增范围更广，还发现了正常结肠上皮中没有发现的正向选择基因。总体研究表明结肠黏膜的体细胞进化可能启动、维持或延续IBD。