2022-04-20

Nature | 体细胞被化学小分子诱导重编程为多能干细胞

骄阳似我 图灵基因 2022-04-20 10:31

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：骄阳似我

IF：49.962

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

细胞重编程可以操纵细胞的身份，以生成所需的细胞类型。本文通过创造一种中间塑性状态，展示了人类体细胞向多能干细胞的化学重编程过程，这些多能干细胞具有胚胎干细胞的关键特征。整个化学重编程轨迹分析描绘了早期阶段中间塑性状态的诱导，在此期间发生化学诱导的去分化，该过程类似于轴突肢体再生中发生的去分化过程。此外，本文还发现JNK途径是化学重编程的主要障碍。本文的化学方法为人类多能干细胞的产生和在生物医学中的应用提供了一个平台。这项研究为开发再生治疗策略奠定了基础，该策略使用定义明确的化学物质来改变人类的细胞命运。

细胞身份是在发育过程中建立，以获得和维持体细胞中的特殊细胞功能。细胞重编程可以操纵细胞身份，从而产生所需的细胞类型，在疾病建模、药物发现和再生医学中提供广泛的应用。利用细胞因子，包括卵母细胞成分和转录因子，小鼠和人类体细胞可以被重新编程为多能干（PS）细胞。本文证明了化学刺激可以通过简单暴露于小分子将小鼠体细胞重新编程为PS细胞。这种化学重编程方法可以在不进行基因操作的情况下协同靶向细胞信号通路和表观遗传修饰物，并为药理学和治疗策略的开发提供了相当大的优势。此外，这种方法还可以实现功能性体细胞类型之间的谱系转换。然而，以前的化学重编程无法从体细胞诱导人类PS（hPS）细胞，这需要完全重置体细胞表观基因组。这种失败可能与以下事实有关：人类体细胞已进化为具有更稳定的表观遗传环境，以保护其细胞身份免受化学干扰。这一过程为动物克服分化障碍提供了线索。例如，轴突中受损的体细胞可以对外部信号做出反应，启动细胞去分化，产生一种可塑状态，其特征是体细胞身份丧失、细胞增殖增加和发育相关基因的重新激活。重要的是，这种可塑状态通常具有相对开放的染色质结构，可接近性增加，这对于诱导新的细胞至关重要。因此，重建这种可塑状态是小分子释放人类体细胞有限潜能并允许hPS细胞生成的关键。

近期，在nature杂志上发表了一篇名为“Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells”的文章，讲述了通过创造一种中间塑性状态，展示了人类体细胞向多能干细胞的化学重编程过程，这些多能干细胞具有胚胎干细胞的关键特征。该文章的化学方法为人类多能干细胞的产生和在生物医学中的应用提供了一个平台。这项研究为开发再生治疗策略奠定了基础，该策略使用定义明确的化学物质来改变人类的细胞命运。

诱导人体体细胞去分化，重点在于筛选破坏成纤维细胞特性、促进细胞增殖和重新激活脱分化相关基因的小分子。经过多次化学小分子的尝试和筛选，用CHIR99021、PD0325901、SB590885、IWP2和Y27632（IV期条件）处理诱导共表达OCT4、SOX2和NANOG（以下简称OSN）的紧密菌落。在转移到人类胚胎干细胞（hES）培养基中后，这些菌落显示出典型的hES细胞形态。进一步从这些来自不同供体的OSN+菌落中获得稳定的细胞系。除OCT4、SOX2和NANOG外，它们还表达多能性细胞表面标记物TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA-4。表明OSN+细胞系在转录组学和表观遗传学方面与hES细胞相似。以后将这些已建立的OSN+细胞系称为人类化学诱导的PS（hCiPS）细胞。此外，hCiPS细胞能够通过在免疫缺陷小鼠体内形成畸胎瘤，在体外通过形成类胚体，在体内形成三个胚层的细胞。除了胎儿成纤维细胞，还从成年体细胞中产生hCiPS细胞。另一项筛选确定了促进重编程和从成人脂肪来源的间充质干细胞（HADSC）生成hCiPS细胞的促进剂。成人体细胞来源的hCiPS细胞的转录组学和表观遗传学特征与hES细胞相似。成人体细胞来源的hCiPS细胞也能够分化为三个胚层的细胞。图1：使用小分子产生HCIPS细胞。

为了进一步了解人类体细胞的化学重编程，对整个重编程过程进行了单细胞RNA-seq（scRNA-seq）分析。使用Waddington OT方法重建重编程轨迹，该方法识别出后代更有可能是hCiPS细胞的细胞，其后代概率被确定为hCiPS细胞分数。然后将重点放在遵循成功重编程轨迹的细胞上，这些细胞进一步分为三种不同的细胞状态：中间可塑状态（R9簇）、胚外内胚层样（XEN样）状态（R11簇）和原始多能性状态（R13簇）。在早期阶段，一个细胞群被诱导，显示出中间再生状态。观察到体细胞程序的下调，随后是一组与胚胎发育有关的基因的上调，以及细胞增殖的增加。基因本体（GO）分析表明，在这种中间可塑状态下被激活的基因在肢体和附件发育方面得到了丰富。在第三阶段，scRNA-seq和免疫荧光分析显示了一组与胚外内胚层（XEN）相关的高表达基因，结果表明，XEN样程序在晚期桥接了多能性获得，与小鼠细胞的化学重编程保持一致。有趣的是，在第四阶段，发现初级hCiPS细胞集落高度表达原始多能性标记。总体而言，确定了人类化学重编程过程中的三个连续关键阶段：早期阶段（第一阶段和第二阶段）获得再生样基因程序，激活XEN程序（第三阶段），以及最终建立原始多能性网络（第四阶段）。图2：从人类细胞到PS细胞的化学重编程的scRNA序列检测。

最近研究表明，成纤维细胞向多能祖细胞的去分化有助于肢体再生过程中胚芽的生成。因此，将scRNA-seq分析重点放在处于中间可塑状态的细胞与人类胚胎肢体芽细胞和轴突肢体再生中的芽细胞，以及不能进行肢体再生的青蛙和小鼠细胞的比较上。结果表明，中间可塑状态的细胞被重新编程，以获得发育中的人类肢体芽细胞的特征，类似于轴突肢体再生的情况，即控制胚胎肢体发育的基因在去分化过程中被重新激活。然而，在青蛙和小鼠中未发现去分化，其中肢体组织在损伤后未显示胚胎基因表达程序的显著激活。接下来，通过搜索在第二阶段结束时中间可塑性细胞中位点打开且表达上调的基因，确定了中间可塑性状态下的基因调控程序。之后，在肢体再生的背景下分析了这种塑料中间体的基因调控程序。该程序在肢体损伤后被激活，用于肢体再生，但在青蛙或小鼠中未被激活，这些物种无法进行肢体再生。值得注意的是，该分析确定了一组基因，包括LIN28A、SALL4、MSX1、MSX2和HOXB9，已知这些基因对促进肢体发育和启动不同组织的再生非常重要。单独敲除这些基因也会损害hCiPS细胞的生成。重要的是，发育调节因子MSX1、MSX2和HOXB9在塑性中间状态下被短暂激活，但在PS细胞中不被激活，对于建立塑性中间状态和诱导hCiPS细胞是必不可少的。这些结果表明，中间可塑状态下存在一个类似再生的基因调控程序，这对于获得细胞多能性是必不可少的。图3：化学物质在早期阶段诱导人类细胞去分化为中等可塑状态。

逐步化学重编程策略可以有效地调节人类体细胞可塑性，为剖析化学物质在重编程中的作用提供了一个平台。在第一阶段，发现去除CHIR99021、616452或TTNPB可显著降低LIN28A的激活，并抑制体细胞程序的下调。在第二阶段，发现c-Jun N-末端激酶抑制剂JNKIN8是获得可塑性特征的关键小分子，包括SALL4的激活和参与胚胎发育的基因。ATAC-seq分析证实，JNKIN8对于II期结束时激活的基因的开放染色质状态至关重要。在II期，JNKIN8的去除严重损害了细胞增殖，SALL4和LIN28A双阳性细胞的频率（延长了）也降低了数据。为了确定JNKIN8如何调节中间可塑状态，在使用或不使用JNKIN8治疗后的第二阶段进行了scRNA-seq分析。发现包括TNF和IL1在内的促炎症途径在未经JNKIN8处理的细胞中显著富集。此外，scATAC-seq分析还表明，在未经JNKIN8处理的情况下，参与这两条通路的基因位点是开放的，这表明这些通路被激活。通过向II期培养物中添加TNF和IL-1β进一步验证了这一结果，这大大削弱了可塑性特征的产生，包括SALL4的激活和细胞增殖，以及随后诱导hCiPS细胞。这些结果表明，JNK通路是一个主要的障碍通过调节促炎症相关途径，重建人体体细胞的可塑性。5-氮杂胞苷是诱导低甲基化状态所必需的，包括与XEN相关的基因，以及在III期和IV期激活的多能性程序。此外，单独移除CHIR99021、616452、TTNPB、JNKIN8和5-氮杂胞苷严重损害了hCiPS细胞的生成。这些结果证明了小分子的化学协同作用，它们操纵内源性细胞途径和表观遗传靶点，有效地将人类体细胞从紧锁的分化状态中解放出来。图4：在早期调节塑性的关键小分子。

本文证明了小分子可以有效地将人类体细胞重新编程为在分子和功能上等同于hES细胞的PS细胞。这为临床级细胞制造提供了一种生成患者特异性PS细胞的新方法。小分子与基因组不整合，高度可控，易于优化、标准化和制造；因此，这种化学重编程方法有望以高度可控且易于标准化的方式开发治疗性重编程策略。本文的研究为人类细胞可塑性的调节提供了机制上的见解，并促进了再生药理学重编程策略的发展。

教授介绍：

卢实春（博士生导师）

卢实春教授于1979年9月至 1984年7月在重庆医学院就读学士学位，1984年9月至1987年7月在华西医科大学医学院就读硕士学位，1992年10月至1995年12月在德国弗雷堡大学医学院就读博士学位，他的主攻专业为肝胆外科肝移植。卢实春教授在1987年7月至2004年3月在华西附一院普外科历任住院医、主治医、主任医师，科室副主任；2004年4月至2014年1月在北京佑安医院普外肝胆暨肝移植中心任科主任；2014年2月至2015年11月在301医院肝胆外科任科主任。

在学术方面，卢实春教授于2014年10月至2017年10月任北京市医学会器官移植分会副主任委员北京市医学会器官移植分会副主任委员；2015年5月至2018年5月任中华医学会外科学分会外科学分会肝移植学组委员；2017年4月至2020年4月任中国医师协会整合医学医师分会整合肝胆外科专业委员会副主任委员等等。

参考文献：

Guan, J., et al., Chemical reprogramming of humansomatic cells to pluripotent stem cells. Nature, 2022.