生信分析＋实验验证探究m6A RNA甲基化调节因子与癌症转移的关系（IF10+）

Analysis and identification of m6A RNAmethylation regulators in metastatic osteosarcoma

转移性骨肉瘤中 m6A RNA甲基化调节因子的分析和鉴定

发表期刊：Mol Ther Nucleic Acids

发表日期：2021 Dec 11

DOI:  10.1016/j.omtn.2021.12.008

期刊相关信息

一、背景

        骨肉瘤（OS）的特征是快速生长和早期转移。目前，OS的主要治疗方法是化疗，然后通过手术切除骨肿瘤。管OS的治疗方案已明显改善，OS患者的5年生存率仍保持在60%-75%，预后仍然较差，并可能导致其他副作用的发生，这些副作用会对患者的生活质量产生重大影响。

        在各种生理和病理过程中，已经发现RNA修饰是转录本表达的一个关键调节因素。N6-甲基腺苷（m6A）作为最常见的RNA修饰类型之一，在最近的研究中引起了极大的关注。根据最近的证据，m6A修饰是一种具有动态和可逆特征的表观遗传变化，可以通过甲基转移酶（METTL3，WTAP，METTL14，RBM15，CBLL1，ZC3H13，RBM15B和KIAA1429，称为“writers”）、去甲基化酶（ALKBH5和FTO，称为“erasers”）和关键m6A结合蛋白（HNRNPA2B1，YTHDF1-3，IGF2BP1-3，FMR1，LRPPRC，HNRNPC，ELAVL1和YTHDC1-2，称为“readers”）等多种调控蛋白调控RNA的剪接、核输出、定位、翻译、降解和稳定性。 结合蛋白。有研究表明，m6A调节器与癌症的发展密切相关，并且可能有望成为癌症的预后生物标志物和治疗靶点。m6A调节器也与OS的进展和预后有关。

二、材料与方法

1.数据来源

从TARGET数据库下载了88名OS患者的RNA-Seq数据以及相应的临床病理信息

2.实验流程

1）提取21个m6A RNA甲基化调节因子的数据：对m6A RNA甲基化的21个调节因子进行了研究，包括8个甲基转移酶，2个去甲基化酶，以及11个m6A结合蛋白

2）相关性分析和PPI网络的建立：构建了包括21个选定的m6ARNA甲基化调节因子的PPI网络

3）GO分析：m6A RNA甲基化的21个调节因子的分子功能

4）关键调节因子的筛选：对21个调节因子进行了单变量Cox回归分析；通过LASSO-Cox回归分析，建立了OS中m6ARNA甲基化调节因素的预后模型

5）预后模型的建立：生存分析；单变量和多变量Cox回归分析

6）RBM15的突变模式和甲基化位点的分析：利用TCGA数据库中SARC样本获得的突变数据对RBM15的突变模式进行分析；利用CCLE数据库评估了RBM15在不同OS细胞系中的甲基化位点

7）m6A RNA甲基化调节因子在其他OS样本中的表达情况：以Oncomine数据库为数据平台

8）RBM15表达与免疫浸润细胞之间的关系：TIMER

9）细胞培养、定量实时PCR检测、伤口愈合试验、迁移试验和侵袭分析、细胞集落形成实验、蛋白印迹、CCK-8检测、IHC、人类肿瘤样本和动物实验

三、实验结果

01 - m6A RNA甲基化调控因子的相互作用和关联性

        考虑到m6A RNA甲基化调控因子在肿瘤的发生和发展中发挥的重要作用，作者利用TARGET数据库中88例OS的全基因组数据，全面研究了21个m6A RNA甲基化调控因子在OS中的作用和功能。首先利用蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析了这21个m6A RNA甲基化调节因子之间的相互作用。分析结果表明，在21个m6A RNA甲基化调控因子中，5个"writers"（METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429和RBM15）与其他因子的相互作用数量最多（图1A），相关节点数最多（图1B）。此外，通过Pearson相关检验探究了21个调节因子之间的关系，发现 "erasers"FTO与ALKBH5和RBM15呈负相关，而与METTL3、METTL14和WTAP呈正相关关系。"writers"WTAP与METTL3和METTL14显示出正相关。还观察到，"readers"HNRNPC与其他因素的相关性最小（图1C）。因此，大多数的m6A RNA甲基化调控因子显示出相互之间的强烈关联。为了研究这些调控因子的潜在机制，进行了基因本体学（GO）分析。如图1D所示，大多数调节因子在调节mRNA代谢过程和调节mRNA稳定性方面富集（图1D和S1），这与m6A RNA甲基化调节因子的功能相符。

图1 21种N6-甲基腺苷修饰物的相关性和相互作用网络

02 - 基于调节因子表达水平的共识聚类

        为了探讨关键的m6A RNA甲基化调控因子的表达水平与OS患者预后的关系，作者根据21个m6A RNA甲基化调控因子的表达水平对所有88例OS进行了共识聚类。通过比较不同的聚类数量，选择K为3作为可接受的标准（图2A和2B）。此外，共识聚类显示，根据各组之间存在的相关程度，可以将样本区分为三个类别（图2C）。分析了这3个聚类的患者的总生存期，观察到第1、2、3组患者的总生存概率有明显差异，这表明m6A RNA甲基化调控因素与OS病例的预后之间存在潜在关联（图2D）。此外，作者比较了这三个亚组的临床和病理特征（包括转移、肿瘤部位、年龄和性别），发现它们之间没有明显差异。然而，他们在不同分组中的几个m6A修饰因子的表达水平表现出明显的差异，如HNRNPA2B1和ALKBH5。HNRNPA2B1在亚群1中表达水平较低，但在亚群2和3中表达水平较高，而ALKBH5则表现出相反的趋势。YTHDC2在亚组2中高表达，但在亚组1和3中不表达，而IGF2BP1则表现出相反的趋势（图2E）。

图2 m6A RNA甲基化调节器的共识聚类和预测分析

03 - 筛选OS中预后不良的关键m6A调节因子并构建生存模型

        对m6A RNA甲基化的每个调节因子进行了生存分析，以进行与OS总生存概率相关的关键调节因子的筛选。如图3A所示，在生存分析结果中，3个调节因子（RBM15、METTL3和LRPPRC）同时表现出最小的P值和最高的风险比。在此，RBM15、METTL3和LRPPRC的表达量增加与生存状况不良相关，表明它们是OS预后不佳的高危标志物。因此，选择了RBM15、METTL3和LRPPRC这三个候选调节因子进行进一步分析。为了更好地预测m6A RNA甲基化调节因子失调的OS的临床结果，在R中进行了LASSO-Cox回归分析，该分析是基于这三个候选因子在OS病例中的表达水平（图3B和3C）。

图3 选择m6A RNA甲基化的三个关键调节因子

        根据风险评分结果，将OS患者分为2个亚组，即高风险组和低风险组，临界点为5（风险评分= 5）。图4A中显示了OS病例的风险评分的排序、生存状态及时间以及基于RBM15、METTL3和LRPPRC表达谱的特征。热图结果显示，三个m6A RNA甲基化调控因子RBM15、METTL3和LRPPRC在高危组中高表达。此外还观察到两个亚组之间的总生存率有明显差异，与低风险组的患者相比，高风险组的患者预后更差（图4B）。为了检验所构建的预后模型的敏感性和特异性，对三个因素进行了时间依赖性的接收器操作特征（ROC）曲线分析，确定了曲线下面积（AUC）值。如图4C所示，AUC值表明，三种调节因子的特征产生了一个具有高准确性的理想模型，预测OS患者生存率的AUC>0.7，这表明它们可能在OS中表现出至关重要的功能。接下来绘制了风险评分（高风险组和低风险组）和临床病理特征（包括肿瘤部位、转移、年龄和性别）之间的关系，大多数高风险组的OS患者有RBM15、METTL3和LRPPRC的表达增加，但与肿瘤部位、转移、年龄和性别没有明显联系（图4D）。

        下一步作者进行了单变量和多变量的Cox回归分析，以评估风险特征是否是患者OS的独立预后指标。所有变量的单变量分析显示，OS患者的不良预后与转移、风险评分和风险组别显著相关，但它们与性别、年龄或肿瘤部位没有关系（图4E）。所有变量的Cox多变量回归分析也表明，转移明显影响患者的总生存率（图4F）。

图4 由RBM15、METTL3和LRPPRC组成的预后签名的产生

04 - m6A RNA甲基化调节因子在转移性和非转移性OS样本中的表达情况

        基于单变量和多变量分析的结果表明，转移是患者预后的独立风险因素，作者随后研究了21种m6A RNA甲基化调节因子的表达情况。使用来自TARGET数据库的转移性（n = 66）和非转移性（n = 22）OS样本的RNA测序数据，对m6A RNA甲基化的最关键调节因子进行了筛选。差异表达分析结果显示，在21个m6A调节因子中，与非转移性OS样本相比，RBM15和WTAP的表达在转移性OS样本中明显上调。然而，结合上述结果，发现在这三个与预后不良相关的候选调节因子（METTL3、LRPPRC和RBM15）中，只有RBM15在转移性OS样本中明显过度表达（图5）。因此，RBM15可能是关键的m6ARNA甲基化调节因子之一，可能在OS的转移机制中具有重要功能。因此，在进一步的分析中重点关注RBM15的功能。

图5 非转移性和转移性骨肉瘤样本中 21 种 m6A RNA 甲基化调节剂的表达

05 - RBM15在其他类型的癌症中的表达

        考虑到TARGET数据库中的OS样本量有限，以及OS的不同亚型具有额外的特征，作者利用Oncomine数据库分析了RBM15在不同类型OS中的拷贝数。RBM15在四种亚型的OS（软骨细胞型OS、毛细血管型OS、成纤维细胞型OS和成骨细胞型OS）中表现出特别高的拷贝数增加事件的频率（图S3A）。有趣的是，在复发性OS样本中，7个样本中有5个的RBM15拷贝数很高（图S3B）（log2拷贝数单位>0），进一步表明RBM15在OS中的关键作用。此外，还调查了RBM15在其他类型肿瘤中的表达，观察到RBM15在几种肿瘤中都有高表达例如宫颈癌（图S4）。还通过使用从癌症基因组图谱（TCGA）获得的数据评估33种肿瘤中RBM15的表达水平与疾病特异性生存率之间的关系（图S5）。这些数据表明，RBM15也可能在其他类型的癌症发展中发挥重要作用，并且它与患者的生存时间表现出特定的关联；然而，其背后的机制还需要进一步分析。

图S3    不同骨肉瘤样本和其他癌症类型中的 RBM15 拷贝数

图S4    RBM15在不同类型肿瘤中的表达。

图S5    在33种肿瘤中分析RBM15的表达与无病间隔期的预后的关系

06 - RBM15的突变分析及其与免疫浸润细胞的关系

        为了进一步探讨RBM15在OS中的功能，作者利用肉瘤（SARC）突变数据分析了RBM15的突变状况。如图6A所示，观察到RBM15的体细胞突变率为0.84%，其中有两个错义突变可能发生在RNA识别基序上（图6A）。此外，使用癌症细胞系百科全书（CCLE）数据库预测了RBM15在不同OS细胞系中的可能甲基化位点（图6B）。通过PPI网络分析进一步确定了与RBM15建立相互作用的蛋白质，发现RBM15主要与两个调节器，即RRN3和DIDO1建立相互作用（图S6A）。观察到RBM15与这两个调节器显示出正相关（图S6B和S6C）。独立的肿瘤浸润性免疫细胞可用于有效预测总生存期，作者利用TIMER数据库研究了RBM15的表达与OS中免疫浸润水平之间可能存在的关联。如图6C所示，RBM15的表达与CD4 T细胞、Timer巨噬细胞和树突状细胞呈负相关，而与其他三种免疫浸润细胞（B细胞、CD8 T细胞和Timer中性粒细胞）没有明显关联。这些观察结果表明，RBM15可能在OS细胞的免疫浸润中发挥关键作用。

图6    RBM15和免疫浸润细胞的突变模式和甲基化位点的分析

图S6    分析RBM15相互作用的蛋白

07 - 验证RBM15在转移性OS细胞系和实际人类临床标本中的表达

        基于生物信息学分析结果显示RBM15在转移性OS样本中高表达，以及发现其与OS患者的预后不良有关，作者通过实时定量PCR和Western blot检测，研究了RBM15在转移性和非转移性OS细胞系中的表达水平。如图7A所示，与非转移性OS细胞系（HOS和MG63）相比，转移性OS细胞系（MNNG和143B）中RBM15的mRNA表达明显增加。Western blot分析也显示了同样的结果（图7B）。此外，还用IHC检测了实际人类临床标本中RBM15的表达。如图7C所示，与非转移性OS组织相比，RBM15蛋白表达在转移性OS组织中明显增加。

        为了进一步确定RBM15在转移性OS中的作用，作者进行了功能缺失和功能增益的分析。作者首先将三种针对RBM15的siRNA转染到MNNG和143B细胞，然后通过定量实时PCR分析评估RBM15 siRNA的抑制作用。RBM15特异性siRNA转染143B细胞和MNNG细胞后，RBM15的表达明显减少。根据siRNA转染的结果，选择最有效的RBM15干扰靶点为慢病毒介导的sh-RBM15靶点，在转移性OS细胞（MNNG细胞系）中产生稳定的RBM15敲除，而将RMB15的表达载体转染到非转移性OS细胞（HOS细胞系）。如图7D和7E所示，在HOS细胞系中转染了RMB15的表达载体后，RBM15的表达明显增加。同时，在MNNG细胞系中，RBM15敲除后RBM15的表达明显下降（图7F和7G）。这些结果表明，作者成功生成了RBM15过表达或敲除的OS细胞系。

图7    RBM15在OS细胞系和人类临床标本中的表达得到验证

08 - RBM15促进OS细胞的迁移，增殖和转移

        为了进一步确定RBM15对OS转移的调节潜力，作者进行了Transwell迁移实验。如图8A所示，与阴性对照组相比，RBM15过表达后，HOS细胞的迁移能力明显增强。相反，MNNG细胞在RBM15敲除后，迁移能力明显受阻。此外，RBM15过表达的HOS细胞的侵袭能力也得到了增强，但在RBM15缺陷的MNNG细胞中却受到了抑制，这一点通过Matrigel侵袭实验得到了证明（图8A）。此外，伤口愈合试验结果进一步证实了RBM15对OS细胞迁移的影响，其中RBM15高表达的HOS细胞在受到划痕时比正常未处理的细胞愈合得更好，而RBM15缺失的MNNG细胞在受到划痕时的愈合效果比正常未处理的细胞更糟（图8B）。增殖能力的改变是通过集落形成试验进一步评估的。如图8C所示，RBM15的过表达明显增强了非转移性OS细胞系的集落形成能力，而RBM15的沉默则明显破坏了转移性OS细胞系的集落形成能力（图8C）。

        此外，为了进一步确认RBM15对OS细胞增殖能力的影响，作者进行了CCK-8检测。如图8D所示，RBM15对维持OS细胞的高增殖率表现出关键性的影响，其中RBM15的过表达和敲除分别明显增强和抑制了OS细胞的生存能力。为了进一步研究RBM15在体内的转移潜力，将RBM15敲除的MNNG细胞注射到裸鼠的尾静脉。4周后，收集裸鼠的肺部并进行分析。如图8E所示，与阴性对照相比，RBM15的缺失明显减少了OS细胞的肺转移。总之，这些发现表明，RBM15在OS细胞的运动性和转移中发挥了作用。

图8 RBM15对骨肉瘤的侵袭、迁移、增殖和转移的作用的验证

四、结论

        作者分析了m6A RNA甲基化的21种调节剂在转移性OS中的表达和预后价值，并利用RBM15沉默和过表达前后的体外细胞学实验以及体内转移模型进一步验证了这些调节剂。发现，m6A RNA甲基转移酶RBM15在OS的发展和转移中发挥了关键作用；因此，它可能是转移性OS患者预后的一个有用的新的候选生物标志物。