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一、传统流式技术的困局

“世界上没有两片完全相同的叶子”，这是一个哲学问题，但也是一个科学事实。复杂的生物体由众多不同类型的细胞组成，每个细胞都是一片 ‘叶子’，这些细胞存在非常大的异质性；一直以来，流式技术是分析复杂细胞群体的重要手段，它可以对细胞进行多参数检测分析，进而区分不同种类的细胞；其所能检测参数的多少，也决定了我们对于所研究群体异质性的深度。

传统的流式细胞仪，其核心原理是基于荧光进行检测，广泛的应用于生物学各个研究领域；但是，由于存在不同荧光基团发射光谱的重叠，会造成很强的通道干扰，使得传统流式技术的发展遇到了瓶颈：

流式通道

其一，荧光的发射信号具有较长的带宽，使得有限的流式信号的检测窗口已经非常拥挤，很难容纳新的检测通道。目前 BD 最高端的分析型流式细胞仪具有 20 个检测通道，而实验室常用的通道数量一般少于 12个。
其二，发射光谱的重叠会导致通道间的信号干扰，当检测通道多于 8 个时，实验设计和补偿计算已经变得相当复杂，使得多参数检测成为了一项复杂且费时的技术性工作。
另外，一些细胞存在自发荧光，在进行基于荧光的检测中，也会对检测结果造成背景噪音干扰。

随着单细胞测序技术的兴起，我们更迫切的要了解细胞群体内部的蛋白表达的各种变化，对流式的通道数量和信号质量有了更高的要求。传统的荧光流式细胞仪已经不能完全满足科研的需要，需要寻求更好的标签和检测系统用于以后的科学研究。

二、流式质谱技术简介

流式质谱细胞术（Mass Cytometry，也称CyTOF）是一种将流式细胞技术与质谱分析技术结合在一起的新技术。这种新的融合技术能够在单细胞水平同时分析超过50种细胞参数，能够分析的参数包括蛋白质、核酸甚至小分子。它继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力，是流式细胞技术一个新的发展方向。

技术原理

质谱流式原理如下图所示，它采用金属同位素标记的特异性抗体来标记细胞表面和内部蛋白，标记好的细胞通过流式细胞技术被分离成单个细胞并依次进入等离子体炬进行离子化，单细胞形成的离子云被送入飞行时间质谱（TOF），检测出每个细胞上各种金属标签的精确含量，得到单细胞的质谱数据，最后，这些数据会被转换为标准的流式数据。

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技术流程

单细胞悬液的制备-染色-上机-分析（结合临床试验的设计，以及生物学和转化医学的不同研究目的和，可以基于质谱流式产生的高维数据进行高级统计和数据可视化）

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金属抗体

质谱流式细胞术的主要创新之一是使用金属元素及其同位素作为抗体标签，常用标签有稀土元素、惰性元素和后过渡金属。所选的同位素是无毒性、非放射性的稳定同位素。使用这些元素的优点是：1）在细胞内含量少，不会引起高的背景噪音干扰。而荧光流式会面临样本自发荧光的干扰；2）不会影响细胞正常的生理功能；3）ICP质谱装置分辨率高，彼此信号无干扰，无需通过计算补偿。

金属标签.png

技术优势

第一、通道数量增加到上百个
质谱流式细胞仪中的ICP质谱装置具有非常宽的原子量检测范围（88～210Da），因此可以同时检测上百个不同的参数。

第二、通道间无干扰，无需计算补偿
ICP质谱具有超高的分辨能力，可以完全区分开用来标记的各种元素。实验数据表明，其相邻通道间的干扰<0.3%，基本可以忽略不计，无需计算补偿。这样不仅使实验流程得到简化，也节约了标本和试剂。

第三、金属标签数量多，并具有极低的背景
用来作为标签的金属元素在细胞中的含量极低，而金属标签与细胞组分的非特异性结合能力极低，所以信号的背景极低。目前用来标记抗体的金属标签有30多种，随着技术进步，更多元素可以用来作为标签，其种类会进一步增加。

第四、多样化的数据处理方式，实现对样品的深入分析。
质谱流式细胞仪通道数量的激增带来信息量的成倍增长。传统的流式分析方法已经不能完全满足需要，所以需要对数据进行各种降维处理，提取出其中包含的有用的生物学信息。常用的分析方法有：SPADE、PCA、viSNE以及Gemstone等。

总体来说，传统流式细胞技术和质谱流式细胞技术相比，主要有两点不同：第一、标签系统的不同，前者主要使用各种荧光基团作为抗体的标签，后者则使用各种金属元素作为标签；第二、检测系统的不同，前者使用激光器和光电倍增管作为检测手段，而后者使用ICP质谱技术作为检测手段。荧光基团发射光谱一般比较宽，其间往往会发生重叠，会带来一些问题：一方面限制了检测通道的数量（<20个）；另一方面，它会带来严重的串色问题，很多通道的信号需要复杂的补偿计算。

质谱流式应用

质谱流式细胞术通过测量蛋白质的量以及修饰状态，从而依据特定蛋白类型鉴定细胞类型或者依据可发挥功能的修饰过的蛋白类型研究细胞内的生物学过程（如信号转导）等，在临床上配合分型诊断以及预后预测。

基础科研应用

1.1细胞分型

通常通过检测细胞表面表达的蛋白种类可以对细胞进行分类。来自斯坦福大学的Sean C. Bendall等人于2011年使用质谱流式细胞术同时检测了细胞34个参数。首先通过检测常规使用的蛋白，对细胞进行分型，得到B细胞，NKT细胞，CD8+ T细胞等[1]。

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1.2信号通路

为了分析人体组织中单细胞水平的信号传导，研究人员利用 CYTOF 技术对临床上收集的福尔马林固定、石蜡包埋的正常及患者肠道标本进行对比分析，发现肠道细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞中肿瘤坏死因子-α的差异信号，表明下游 RAS-RAF-MEK 途径决定杯状细胞的特性[2]。

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临床科研应用

寻找与疾病发生、发展、复发相关的生物标志物（早期诊断、伴随诊断、复发预测）。
免疫系统动态监测，寻找与临床结果相关的生物标志物（治疗有效人群筛选、药效分析、预后评估）。
辅助进行疾病分型、分级。
特定人群、部位的免疫特征分析（如孕妇、胎儿、肠道等）。

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已预后评估为例，浙江大学附属第一医院梁廷波教授分析肝癌（HCC）样本与正常组织样本的免疫微环境差异显著，而8个HCC患者之间的差异也很大。根据差异基因表达聚类出3个亚型，这些亚型的免疫细胞组成差异较大。简单的说，亚型2 的特征是较低的淋巴细胞浸润，以及较高的树突细胞与NK细胞组成。亚型3中Treg、Breg以及M2极化巨噬细胞较多，这些细胞都是免疫抑制细胞。亚型1具有正常的T细胞浸润水平，但是B细胞浸润水平较差。从PD-1, PD-L1, CTLA-4以及Tim-1的表达上看，这些免疫抑制分子在亚型3中表达上调。根据免疫细胞功能与分布，我们将亚型1、2、3定义为免疫能力型、免疫缺陷型、以及免疫抑制型。根据免疫组分与免疫功能，作者将HCC分为三个亚型。这些亚型有着独特的代谢特征与细胞因子表达，或可被用于患者的预后评估[3]。

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常用的金属抗体Panel

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【参考文献】

Bendall & Simonds et al., Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science , 2011, 332: 687-96.
Simmons, A.J., et al., Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks. Science Signaling,2016, 9(449): 11.
Zhang Qi, et al., Integrated multiomic analysis reveals comprehensive tumour heterogeneity and novel immunophenotypic classification in hepatocellular carcinomas.Gut, 2019, 68: 2019-2031.

流式质谱技术简介