Genetic Determinants of EGFR-Driven Lung Cancer Growth and Therapeutic Response In Vivo
cancer discovery 29.497
思路
小鼠突变+多基因敲除模型构建→EGFR突变条件下tuba-seq定量研究抑癌基因功能→抑癌基因敲降促进肿瘤增长→apc、Rbm10抑癌基因肿瘤抑制的验证→KRAS和EGFR突变下的敲降抑癌基因后肿瘤抑制景观差异→抑癌基因与致癌驱动因子的高度上位性决定了人肺腺癌突变模式→用药+tub-esq→Keap1失活限制了肿瘤对osimertinib的反应（小鼠用药试验）→临床数据中osimertinib耐药病人发生Keap1的突变（失活）
abstract
①在EGFR驱动的Trp53缺陷型肺腺癌小鼠模型中，通过量化10个可能的抑癌基因的失活效果，我们发现Apc、Rb1或Rbm10失活强烈促进肿瘤生长。
②出乎意料的是，在Kras驱动的模型中，Lkb1或Setd2的失活是最强大的生长驱动因素，它减少了EGFR驱动的肿瘤生长。这些结果与人类EGFR-和KRAS-腺癌的个突变频率一致。
③此外，Keap1失活降低了EGFR驱动的肿瘤对EGFR抑制剂osimertinib的敏感性，KEAP1通路的突变与酪氨酸激酶抑制剂治疗患者的时间缩短有关。我们的研究强调了基因改变的影响在不同的致癌背景下是如何不同的，以及治疗后健康状况的变化。
Statement of significance
①通过在体内模拟复杂的基因型，本研究揭示了抑制EGFR突变肿瘤生长的关键肿瘤抑制因子。此外，研究表明keap失活降低了这些肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性。
Intriduction
①尽管肿瘤的基因组结构复杂，但通常是根据单一的致癌基因突变来分类的，而同时发生的抑癌基因改变的功能却被忽略了。有新的证据表明，致癌因子和抑癌基因之间的相互作用可能影响肿瘤适合性和治疗反应
②然而，基因组改变的巨大组合景观使得仅从人类癌症测序数据中收集有关肿瘤抑制基因和癌基因之间上位性相互作用的信息变得困难，除非在最极端的情况下
③在肺腺癌中，EGFR和KRAS是两个最常见的癌基因突变驱动基因，发生在多种推测的抑癌基因基因改变的背景下
④TKIs的应答率很高，但是，患者应答的深度和持续时间有很大的差异，不可避免地会出现获得性耐药（14）。
⑤基因组改变，包括RB1和TP53的改变，已经被发现与TKI治疗的临床结果相关（13，17，23）。然而，考虑到这些肿瘤基因组改变的复杂性和多样性，肿瘤抑制基因型对TKI敏感性和耐药性的功能作用仍然不清楚。
⑥为了量化一组10种不同的假定抑癌基因在体内致癌EGFR驱动的肺肿瘤生长中的功能重要性，我们将CRISPR–Cas9介导的体细胞基因组编辑和肿瘤条形码测序（Tuba-seq）与一种新的EGFRL858R驱动的Trp53缺陷的基因工程小鼠模型耦合肺癌。通过比较致癌EGFR-和Kras驱动的肺癌模型中的抑癌作用，我们发现致癌驱动因子和抑癌因子之间普遍存在上位性（prevalent epistasis），这解释了致癌EGFR-和Kras驱动的人肺腺癌中这些抑癌基因的不同突变谱。
Result
1、慢病毒Cre致癌EGFR肺腺癌小鼠模型的建立
①病毒Cre启动的致癌Kras驱动的肺癌模型的简单性使我们能够分析在这些个原位小鼠模型中协同驱动肿瘤生长的许多基因（补充图S1A）（26）。
②为了使病毒启动的致癌EGFR-driventRp5基因缺陷型肺肿瘤的发生，我们培育了一种rtTA/四环素诱导的转基因小鼠，该转基因编码普通肺腺癌相关的EGFRL858R突变体（TetO-EGFRL858R），一种Cre调节的rtTA转基因（Rosa26CAGs-LSL-rtTA3-IRES-mKate，缩写为R26RIK），纯合的Trp53-flox等位基因（p53flox/flox）（27-29）。在这些TetO-EGFRL858R；Rosa26RIK；p53flox/flox（EGFR；p53）小鼠中，肺上皮细胞的慢病毒Cre转导导致rtTA和mKate的表达以及Trp53的失活。多西环素联合治疗可诱导致癌EGFR的表达（图1A）。
③我们在EGFR、p53小鼠中用慢病毒PGK-Cre载体（30）启动肿瘤，并使用磁共振成像（MRI）监测肿瘤发展（图1B）肿瘤发生8周后，在EGFR和p53小鼠中检测到。肿瘤发生11周后对肺部进行组织学分析，证实发生多灶性肺腺癌（图1B，下图）。
④肿瘤对EGFRL858R和mKate以及表面活性蛋白C（SP-C）和肺系定义转录因子NKX2.1/TTF-1呈阳性染色（图1C，顶面板和补充图S1B）（31-33）。
⑤重要的是，在这个模型中，肿瘤比在先前的CCSP rtTA中快速发展的弥漫性肿瘤灶性更聚集（focal）；TetO-EGFRL858R模型（27），可能是由于在病毒启动的模型中，肿瘤起源于较少的细胞（图1B，右上图）
⑥慢病毒诱导的EGFR肿瘤；p53小鼠比CCSP rtTA中典型观察到的小鼠分化更差；TetO-EGFRL858R模型（图1B，下图）显示微乳头型的发病率增加，已知其在人类腺癌中具有高度侵袭性（27）。因此，这种新的慢病毒C再启动模型再现了人类致癌EGFR-驱动的TP53缺陷型肺肿瘤的遗传和组织病理学特征。
2、EGFR驱动肺肿瘤抑癌基因功能的多重定量研究
①为了在EGFR；p53模型中实现体细胞基因组编辑，我们进一步整合了Cas9等位基因（Rosa26LSL-Cas9-GFP）（4）来产生TetO-EGFRL858R；R26RIK/LSL-Cas9-GFP；p53flox/flox（EGFR；p53；Cas9）小鼠（图1A）。慢病毒Cre传递到EGFR；p53；Cas9小鼠引起表达EGFRL858R、mKate、Cas9和GFP的多灶性肺腺瘤和腺癌（图。1C，D）。EGFR；p53；Cas9小鼠的肿瘤组织学与EGFR；p53小鼠相似（图。1B，D）。
②我们使用Tuba-seq方法的改进版本来量化致癌EGFR驱动的肺肿瘤中的抑癌基因功能（补充方法）。条形码慢病毒载体的基因组整合唯一地标记每个转导细胞和克隆性肿瘤内的所有肿瘤细胞（8）。每个条形码编码一个特定于sgRNA的8核苷酸sgID区域，随后是一个随机的15核苷酸条形码（sgID BC）；因此，来自大块荷瘤肺的sgID-BC区域的高通量测序可用于量化每个基因型的每个肿瘤中的细胞数量（补充方法）
③使用这种方法，通过将每个唯一条形码的读取次数归一化为添加到每个样本的基准对照细胞的读取次数，计算每个肿瘤中肿瘤细胞的绝对数量（图2A、补充图S2A和补充方法）。因此，Tuba-Seq能够平行分析多种抑癌基因改变对体内肿瘤生长的影响。
④为了评估在人类肺腺癌中经常改变的十种不同的假定肿瘤抑制基因的功能，我们用一组条形码（barcode）的Lenti-sgRNA/Cre载体（Lenti-sgTSPool/Cre；图2A）在EGFR、p53和EGFR、p53、Cas9小鼠中启动肿瘤。
⑤除了靶向每个假定的肿瘤抑制基因的Lenti-sgRNA/Cre载体外，这个库还包含阴性对照载体，包括四个Lenti-sginant/Cre载体和一个靶向Trp53的sgRNA载体（在EGFR；p53；Cas9小鼠中已经被Cre介导的重组灭活，图1A）（8）。
⑥在EGFR、p53、Cas9小鼠肿瘤发生4周后，MRI首次检测到Lenti-sgTSPool/Cre引起的肿瘤。肿瘤发生后11周，当所有小鼠都能检测到肿瘤时，收集荷瘤肺进行Tuba-seq分析和组织学检查（图2B和补充图S1E）。
3、推测肿瘤抑制基因对EGFR驱动的肺癌生长有明显的影响
①我们使用Tuba seq定量EGFR；p53模型中基因型克隆性肿瘤中肿瘤细胞的数量，并使用两个汇总统计来描述肿瘤大小分布（肿瘤大小分布百分位数和对数正态平均值（补充方法；图2C-E和补充图。S3A、B（8）
②通过观察与对照组比较，观察sgRNAs对肿瘤生长的影响，并探讨其与对照组比较的sgrnas的差异性以及影响的大小。肿瘤EGFR中每个sgRNA；p53小鼠，缺乏Cas9等位基因，其大小分布非常相似（图2D）。此外，EGFR中，每个slot sg惰性/Cre载体或slot-sgp53/Cre载体启动肿瘤；p53；cas9小鼠的肿瘤大小分布非常相似（图）。2C，E）。
③Rb1、Apc和Rbm10的失活最显著地增强了癌基因EGFR驱动的Trp53缺陷型肺肿瘤的生长（图。2C，E）。虽然RB1失活在EGFR驱动的肺腺癌中的重要性已经开始被研究（23，34），但很少有研究涉及APC通路在EGFR驱动的肺腺癌中的功能重要性
④有趣的是，RBM10是一种RNA结合蛋白和剪接调节因子，在癌症中的研究很少，以前还没有被认为是EGFR驱动的肺癌生长的关键调节因子（12，36-38）。Rbm10是一个X连锁基因，然而，我们没有发现Rbm10失活对肿瘤大小的任何性别特异性影响（补充图S2B）。更广泛地说，在所研究的TSGs 中，雄性和雌性小鼠的LN平均值和相对于惰性肿瘤的第95百分位的肿瘤大小相似（补充图S2B）
⑤Rb1、Apc和Rbm10的失活最显著地增强了癌基因EGFR驱动的Trp53缺陷型肺肿瘤的生长（图。2C，E）。虽然RB1失活在EGFR驱动的肺腺癌中的重要性已经开始被研究（23，34），但很少有研究涉及APC通路在EGFR驱动的肺腺癌中的功能重要性（35）。
⑥有趣的是，RBM10是一种RNA结合蛋白和剪接调节因子，在癌症中的研究很少，以前还没有被认为是EGFR驱动的肺癌生长的关键211调节因子（12，36-38）。
⑦Rbm10是一个X连锁基因，然而，我们没有发现Rbm10失活对肿瘤大小的任何性别特异性影响（补充图S2B）。更广泛地说，在所研究的TSGs 215中，雄性和雌性小鼠的LN平均值和相对于惰性肿瘤的第95百分位的肿瘤大小相似（补充图S2B
⑧令人惊讶的是，Lkb1或Setd2的失活– 在类似的致癌基因Kras驱动的肺肿瘤模型中，哪些是强抑癌基因– 相对于惰性肿瘤（8，39，40），肿瘤生长显著减少。这些效应在肿瘤大小分布的多个百分位上是一致的，并通过肿瘤大小LN平均值进行评估（图。2C，E）。
⑨值得注意的是，sgSetd2、sgLkb1、sgSmad4、sgApc、sgRbm10和sgRb1观察到的显著效应，即使在我们模拟切割sgRNAs的效率降低50%后，或者当我们使用其他策略进行子抽样时，都被重新捕获，强调了我们发现的稳健性（补充图）。S2C、D和补充图。S4A，B）。
⑩这些结果表明，在特定情况下，被认为是肿瘤抑制剂的基因失活可能对癌症生长产生有害影响。其他抑癌基因226（Atm、Arid1a、Cdkn2a和Keap1）在本实验中没有显著改变肿瘤生长（图。2C，E）。
（11）为了评估肿瘤生长后期的抑癌基因功能，我们在EGFR、p53、Cas9小鼠中启动肿瘤，lenti-sgTSPool/Cre减少10倍，并在肿瘤生长19周后进行TubaSeq（补充图）。S1C-H）。
（12）此时，肿瘤的组织学与肿瘤发生11周后观察到的相似（补充图。S1C，D）。
（13）Tuba序列分析证实了Rbm10、Apc和Rb1的肿瘤抑制功能（补充图。S3A-D）。
（14）由于我们在本实验中使用了10倍的低病毒滴度，因此肿瘤比例减少（补充图S1F），这降低了Tuba-seq分析的分辨率。Cdkn2a或Arid1a的失活在这19周的时间点对肿瘤生长有积极影响（但在11周的时间点没有），这表明这些肿瘤抑制基因在该模型肿瘤发生的后期阶段可能发挥作用（补充图。S3A，B）。
4、Apc和Rbm10介导的肿瘤抑制的验证
①我们进行了进一步的实验来证实两个研究较少的肿瘤抑制剂Apc和Rbm10对EGFR驱动的肿瘤生长的作用。我们在EGFR、p53和EGFR、p53、Cas9小鼠中用Lenti-sgApc/Cre、Lenti-sgNeo2/Cre（sg惰性）和两个Lenti-sgRbm10/Cre载体启动肺肿瘤，每个载体都有一个独特的靶向Rbm10的sgRNA（N=3 EGFR；p53mice/组和N=5 EGFR；p53；Cas9小鼠/组；图3A）。
②我们使用了两个靶向Rbm10的sgrna来增强我们的研究结果，因为rbm10的抑瘤作用在EGFR驱动的肺组织中仍然是完全没有特征的癌症。灭活Apc或Rbm10在EGFR；p53；Cas9小鼠产生的肿瘤大于对照组sgNeo2在EGFR；p53；Cas9小鼠（补充图。S5A，B）。
③此外，通过量化组织切片中单独的sgApc或sgRbm10肿瘤的大小，我们观察到EGFR；p53；Cas9肿瘤比EGFR；p53小鼠的肿瘤大（图。3B-E）。
④L enti sgApc/Cre-在EGFR中引发肿瘤；p53；Cas9小鼠具有更多癌细胞，β-连环蛋白稳定和核定位，以及Sox9表达增加（与APC失活一致）（补充图。S5C，D）（41）
⑤。此外，至少50%的Lenti-sgRbm10/Cre在EGFR；p53；Cas9小鼠中启动肿瘤，缺乏或具有较低的Rbm10蛋白水平（补充图S5E）。
⑥Apc或Rbm10失活的肿瘤在组织学上与EGFR中的肿瘤相似；p53小鼠在这个时间点具有乳头状/腺泡状或微乳头状结构--具有中高级核
⑦所有肿瘤的腺癌标志物（NKX2.1/TTF-1和SP-C）为阳性，神经内分泌标志物突触素（SYP）和UCHL1以及鳞状细胞癌标志物（p63）为阴性（补充图S7）癌细胞高度增殖，而凋亡细胞在GFR；p53；Cas9小鼠的肿瘤中很少见，用Lenti-sgApc/Cre或Lenti-sgRbm10/Cre启动（补充图S7）。
⑧这些结果进一步证实了这些抑癌基因在抑制EGFR驱动的肿瘤生长中的重要性。总的来说，我们的研究结果强调了将Tuba-seq和CRISPR–Cas9介导的体细胞基因组编辑与我们的病毒诱导小鼠模型结合起来分析致癌的EGFR驱动的肺癌的基因功能的价值
5、致癌驱动因素塑造了肿瘤抑制的适宜性景观
①不同的致癌因素在多大程度上影响了肿瘤抑制的情况，这几乎是完全未知的。我们通过比较抑癌基因EGFR和Kras驱动的肺肿瘤的肿瘤抑制情况来探讨这个问题。我们重复了我们小组先前进行的一项实验，其中我们灭活了同一组抑癌基因inKrasLSL-G12D/+；p53flox/flox；R26LSL-277Tomato；H11LSL-Cas9（Kras；p53；Cas9）小鼠，并使用了与用于EGFR；p53和EGFR；p53Cas9 mice的肺相同的文库制备方法和分析管道；（补充图S8A）（29、30、42）。
②Lkb1、Setd2和Rb1的失活是致癌Kras驱动Trp53缺陷型肿瘤生长的强大驱动因素，而Rbm10、Apc、Cdkn2a和Arid1a的失活也适度增加了肿瘤生长（图。4A，B）。
③结果与我们之前对Kras、p53、Cas9小鼠的Tuba-seq分析以及对致癌Kras驱动的肺癌小鼠模型284中这些基因的其他研究基本一致（补充图S1A）（9，39-41，43-47）
④几种抑癌基因（如Rb1）的失活对EGFR-和Kras-驱动的肿瘤具有相似的作用，这表明这些抑癌基因限制了肺腺癌的生长，而与致癌背景无关（图4C和补充图S8B）。
⑤然而，LKB1或Setd2的失活大大增加了致癌基因Kras驱动的肺肿瘤的生长，但降低了致癌基因EGFR驱动的肺肿瘤的生长（图2C，E，图4A-C和补充图S8B）。
⑥因此，在特定情况下，肿瘤抑制因子基因失活的后果不仅限于肿瘤抑制效应的大小，而且还可以表现为相反的效应（known as the sign epistasis），即使致癌驱动因素（在本例中，EGFR和Kras）传统上被认为是在线性途径内
6、抑癌基因与致癌驱动因子的高度上位性决定了人肺腺癌突变模式
①为了将我们的功能数据与在人类肺腺癌中发现的抑癌基因突变谱进行比较，我们查询了AACR项目GENIE数据库（48）中的数据。我们计算了与基因EGFR（L858R，外显子19缺失，L861Q，G719X）或致癌KRAS（密码子12，13302或61）突变和TP53突变共同发生的肿瘤抑制基因突变的频率。这一分析显示，在EGFR/TP53突变型肺腺癌中，RB1、RBM10和APC经常发生改变。②RB1突变 与KRAS/TP53肿瘤相比，EGFR/TP53肿瘤更常见（7.5%对3.1%）。然而，在小鼠的EGFR和Kras突变肿瘤中，Rb1失活是肿瘤生长的主要驱动因素（图。2C、E和图。4A-C）。
③小鼠和人类之间的这种差异可能与人类KRAS/TP53突变肿瘤（7.3%，图4D）中CDKN2A的更高频率改变有关，这将破坏与RB1失活相同的细胞周期途径。
④LKB1/STK11和SETD2是KRAS/TP53突变型肺腺癌中最常突变的抑癌基因（图4D）（49，50）。进一步支持EGFR/TP53中LKB1和SETD2的功能与KRAS/TP53突变型肺腺癌中的差异，与EGFR/TP53肿瘤相比，KRAS/TP53突变型肿瘤中这些基因的突变的频率明显更高（图4E）。
⑤当我们将我们的分析扩展到包括所有肿瘤而不考虑TP53突变状态时，致癌EGFR或KRAS驱动的肺肿瘤中LKB1或314SETD2突变频率的这种不对称性也是显著的（补充图S8C）。
总之，小鼠和人类的数据表明，突变模式可以反映肿瘤抑制基因和致癌驱动因素之间深刻上位性的后果。
7、Keap1失活限制了肿瘤对osimertinib的反应
①基因工程小鼠模型提供了对EGFR-321驱动的肺肿瘤生物学的洞察，并证明了对研究EGFR 322TKIs耐药机制的价值，特别是对靶向耐药机制的研究（27，51-53）。TKI奥西美替尼最近被批准用于GFR驱动的肺腺癌的一线治疗。然而，参与调节对西美替尼的应答深度和耐药机制的途径仍在研究中（54，55）。
②为了确定抑癌基因如何影响肺肿瘤对EGFR抑制的治疗反应，我们用osimertinib治疗了EGFR；p53；Cas9小鼠的扁豆sgTSPool/Cre引发的肿瘤两周从肿瘤发生后9周开始（图5A）
③与载体治疗的EGFR；p53；Cas9小鼠相比，Osimertinib治疗显著降低了小鼠的总体肿瘤负担（补充图。9A-D）
④通过EGFRL858R染色，残留的肿瘤细胞稀疏，这些细胞没有增殖（补充图。S9E-F）。
⑤肿瘤发生17周后开始2周治疗时，总体肿瘤反应相似（补充图S9G-J）。
⑥EGFR；p53；Cas9小鼠中的残余肿瘤保留了肺腺癌特征，并且在两周的osimertinib治疗后没有表型变化（例如小细胞肺癌（SCLC）转化）的证据（补充图S10A）。
⑦为了量化体内灭活每个抑癌基因对osimertinib反应的影响，我们在肿瘤发生后11周和19周对osimertinib治疗的EGFR；p53；Cas9小鼠的肺进行Tuba-seq，并将结果与载体治疗的对照组的Tuba-seq结果进行比较（图5B和补充图）。S11A，B）。与影像学数据和组织学分析相一致，osimertinib治疗大大减少了肿瘤负担，如Tuba-seq所评估的（比较图。2C、E、图5B和补充图。S3A，B 和S11A，B；补充方法）。
⑧经过两周的osimertinib治疗后，Apc、Rb1或Rbm10的失活仍然与较大肿瘤相关，而其他TSG失活的肿瘤的大小分布仍然与具有惰性sgRNAs的肿瘤相似（比较图5B和图2E，补充图S11A和图2C，补充图S11B和补充图。S3A，347B）。
⑨最明显的例外是sgKeap1的肿瘤。在载体治疗的小鼠中，sgKeap1肿瘤的大小分布与含有惰性sgRNAs的肿瘤几乎相同；然而，在osimertinib治疗的小鼠中，sgKeap1肿瘤明显大于含有惰性sgRNAs的肿瘤。这表明Keap1的失活限制了对osimertinib的反应（5B）。在肿瘤发生后19周，也观察到Keap1失活产生的Osimertinib耐药性（补充图。11A，B）。
⑩我们应用了我们先前开发和验证的分析方法来量化基因型特异性反应（图5C和补充图5）。S11C-G；补充方法）（56）。通过比较观察到的osimertinib治疗小鼠肿瘤大小分布的LN平均值与基于总体药物效应的预期肿瘤大小分布，我们可以估计基因型特异性药物反应（ScoreRLM；图5C和补充图S11C）。
（11）肿瘤发生后11周，osimertinib治疗2周后，sgRb1肿瘤比预期小25%（P=0.04）。相反，Keap1失活的肿瘤比预期的大48%（P=0.07；图5C）。肿瘤发生后19周，Keap1失活的效果更大，肿瘤比预期大274%（P=0.13；补充图S11C）。
（12）考虑到sgKeap1在两个时间点的ScoreRLM值（肿瘤发生后11周和19周分别接受治疗两周后，ScoreRLM值分别为0.57和1.90），我们将这两个独立的P值结合起来，证实Keap1失活显著降低了对osimertinib的治疗反应（Fisher方法，P值=0.05）。其他基因型特异性反应的统计测量，包括相对肿瘤数（ScoreRTN）和相对几何平均数（ScoreRGM）在治疗组和未治疗组之间没有显著差异（补充图S11D；补充方法）。
（13）我们的分析方法使我们能够发现，当对较大肿瘤的影响更大时，SCORERTN和ScoreRGM的敏感性更低；补充图。S11E-G；补充方法）。因此，我们的数据与Keap1失活所产生的耐药性一致，在较大的肿瘤中更为明显。
8、Keap1缺陷型肿瘤对osimertinib的敏感性降低，这与临床结果相关
①为了进一步研究这些发现，我们用Lenti-sgKeap1/Cre在EGFR；p53和EGFR；p53；Cas9小鼠中启动肿瘤，然后用osimertinib或载体治疗（图。5D，E）。Osimertinib治疗减少了EGFR中肿瘤的大小和数量；与载体治疗的EGFRp53小鼠相比，小鼠减少了肿瘤的大小和数量；（图5D和补充图。S12A，B）。
②相反，与载体治疗的EGFR、p53、Cas9小鼠相比，西莫替尼治疗的Lenti-sgKeap1/Cre引发的肿瘤在EGFR、p53、Cas9小鼠中没有减小肿瘤大小或数量（图。5D、E 383和补充图。S12A，B）。
③与CRISPR–Cas9介导的基因组编辑在体细胞中的低效性相一致，一些肿瘤在EGFR；p53；Cas9小鼠中通过Lenti-sgKeap1/Cre启动，保留了Keap1蛋白（图5E，顶面板）。
④然而，在osimertinib治疗的EGFR、p53、Cas9小鼠中仍有386个肿瘤存在，它们的Keap1 387水平均为中-低/阴性（图5E）。
总之，这些数据表明，尽管在致癌EGFR驱动的肿瘤生长过程中，Keap1失活没有被积极选择，但osimertinib治疗选择了Keap1低或缺失的389个癌细胞，从而降低了对药物的治疗反应。
⑤为了将我们的研究结果与临床数据相关联，我们分析了KEAP1通路改变对EGFR/TP53突变型肺癌患者EGFR抑制结果的影响。KEAP1通路失活的致癌EGFR驱动的肿瘤被认为对TKIs反应较低，我们在EGFR/TP53肿瘤中证实了这种关联（图。6A，B）（57）。
⑥即使在对年龄、性别、种族和吸烟状况等潜在混杂因素进行了调整后，这一点仍然显著（补充表S3）。在其他几种肿瘤抑制基因型中，KEAP1通路的改变是校正多个假设检验后敏感性有限的最重要驱动因素（图6B）。
⑦我们还分析了一组致癌EGFR肺腺癌患者样本，这些样本是在一线TKI治疗前通过Yale lung Rebiopsy Program（YLR）收集的，在TKI产生耐药性后收集的（图6C；补充表S4）。在18例EGFR和TP53突变肿瘤患者中，有2例复发时KEAP1发生改变（TKI-R406例）。一个病例具有获得性错义突变（Y206N），该突变位于KEAP1 407的一个结构域中，该结构域参与与Cullin3形成复合物以介导408NRF2（由NFE2L2编码）的泛素化和降解（58）。另一个仅在耐药时分析的肿瘤有KEAP1杂合缺失（图6C）。此外，我们还观察到两例NFE2L2拷贝数增加（一例在治疗前检测到并保持耐药，另一例仅在耐药时检测到）和一例CUL3杂合子缺失。总之，我们的体内功能结果与人类数据一致，并支持KEAP1通路的改变在降低EGFR-TKI敏感性中的作用。