免疫荧光染色

细胞免疫荧光染色（培养板中染色）
1．固定：培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
2．在含0.1% Triton X-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
3．羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。
5．去除一抗后，细胞用PBS洗三次。
6．滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；
7．防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
8．荧光显微镜观察拍照。
《细胞培养》司徒镇强版（爬片）：
用品：
（1）0.01mol/L、pH 7.2的PBS：称取NaCl 8g，Na2HpO4 1.15g，KH2PO4 0.2g，加蒸馏水至1000ml溶解后，调至pH7.2.
（2）0.5mol/L、PH9.5的磷酸盐缓冲液（CB）：称取NAHCO3 3.7g，NACO3 0.6g加蒸馏水至100ml，溶解后调pH至9.5；
（3）50%纯：1份纯甘油一份CB；
（4）伊文蓝溶液：称取伊文蓝1g，加入100ml PBS中，溶解后加1mL 1% NaN3，过滤，4℃保存。临用前取0.1mL，加9.9mL PBS稀释成0.01%浓度使用。
（5）一抗、二抗
（6）盖片染色缸、湿盒、温箱、震荡仪、荧光显微镜。
1 细胞的准备与固定：爬片，待细胞接近长成单层，取出盖玻片，浸入PBS（0.01mol/L，PH7.4）洗两次，然后根据实验目的，选择适当固定剂固定细胞（95% 乙醇，10-30min或丙酮5-10min）；
2 将已固定的细胞盖玻片放入染色缸中，用PBS振洗5min，取出吹干。
3 滴加适当稀释的特异性抗体，置湿盒内，37℃保温30-60min或4℃冰箱中过夜。
4 FPS振洗3次，每次5min，吹干。
5 滴加适当西式的荧光素标记抗体（用0.01%伊文蓝溶液稀释）在湿盒中，37℃保温30-60min；
6 用PBS振洗2次，每次5min，然后用蒸馏水振洗一次；
7用50%甘油封片；
文献中：Immunofluorescence
1 用含有4%多聚甲醛的PBS将细胞固定30min（Cell cultures were fixed with PBS containing paraformaldehyde (4%) for 30 min.），PBS洗涤几次后，细胞在0.1% Triton X-100(不含nectin（粘连蛋白）染色)和1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中渗透1小时。PBS冲洗片刻后，将细胞置于室温下孵育2小时，在相同的阻断液中稀释一抗。PBS冲洗后，用Alexa 488或 Alexa 594 孵育45min。细胞经PBS冲洗后，它们立即用封片剂封片，并在与Zeiss Axiovert 200荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜(LSM510 Meta)下进行检测。荧光强度在MetaMorph v6.2r6软件中进行量化。
2 4孔培养板，PBS冲洗，4%甲醛固定10min，随后，用PBS甘氨酸(100mm)洗涤凝胶，室温下在1% IgG山羊抗小鼠免疫荧光(IF)缓冲液中封闭培养基中孵育1.5 h。用一抗孵育，在IF缓冲液或PBS中稀释，4℃过夜。所用抗体为小鼠抗NeuN 1:50稀释，鼠抗Sv2 1:500稀释，鼠抗Tau 克隆T461:100稀释。缓冲液冲洗后，用二级Alexa Fluor-488和-594结合的山羊抗小鼠抗体和山羊抗兔抗体孵育凝胶，按1:400稀释，室温下孵育1h, ImageJ software (NIH)软件定量荧光强度。