CRISPR/Cas 9：载体构建（一）

以张锋的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9载体为例：从Addgene数据库中检索该质粒的序列http://www.addgene.org/42230/，点击 View all sequences，点击
GenBank，即可下载该载体序列，结构示意图如下：

Fig1.png

U6 是真核生物的一个III型基因，这里的U6不是基因，而是它的启动子，负责启动sgRNA的转录。
使用这个载体唯一需要修改的就是sgRNA中的guide sequence，即BbsI这个酶切位点中间的序列，也就是下方序列的蓝色碱基。把这部分序列替换为你所要敲除的基因的一段序列即可，一般只要20bp。
那么怎么替换呢？
因为提供了BbsI的两个酶切位点，所以替换就方便多了。
如果已经得到靶基因的20nt的靶序列，接下来就该Clone Manger登场了。复制这20nt的序列（以AAGGACAAGGACTTCCTGGA序列为例），打开Clone Manger，依次点击菜单栏File-->>Import from Clipboard,导入序列后，在依次点击Clone-->>Modify Ends-->>Custom，按如下添加碱基：

Fig2.png

为什么添加这几个碱基呢？因为这是BbsI酶切后的粘性末端。BbsI为一个IIs型酶，它的酶切位点和识别位点并不一致。
点击左下方Sequence，出现带有粘性末端的DNA链，它的正链和反链就是需要发给公司的引物（Primer），那怎么导出呢？

Fig3.png

我们知道正链的方向就是5'—>3'，可以直接复制粘贴，那反链呢？
Copy完正链后，依次点击Operations-->>Process Molecule-->>Invert molecule-->>OK，将其翻转，即原来的正链变为负链，原来的负链变为正链，就可以直接复制粘贴了。
大神文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23287718