2019-Feb-Week3 Characterization of Bombyx Embryo Segmentation Process: Expression Profiles of Engrailed, Even-Skipped,Caudal, and wnt1/Wingless Homologues
摘要
为了进一步了解家蚕划分体节的过程，家蚕胚胎阶段eve,en,cad,wg的转录本的表达可采用全胚胎原位杂交的方法证实。由家蚕属于短胚带昆虫这一事实可证实对控基因eve的纹路和体节基因en,wg的纹路可继续延续从前致后的划分体节过程。然而，不像稍早描述的短胚带昆虫，家蚕的体节形成的发生没有显著的胚带的延伸：与先前描述的短胚带昆虫相比其生长区变大了。这可能暗示，在由短胚带向长胚带的转变中，家蚕处于生物进化上的中间阶段。cad,wg表达在短胚带昆虫生长区，最初在体节形成中表现为大片的中间表达区域，稍后退回到尾端。这在昆虫中也是独一无二的。详细分析他们之间的相关表达，表明wg区比cad区后退更快，双色原位杂交表明eve纹显示出了停止表达wg纹的细胞。家蚕胚胎发育的另一特有的方面表现在：与其他昆虫相比，其胚胎阶段后即形成原肠胚，并且从前致后的形成过程较慢。基于以上这些结论，我们可对于昆虫体节形成机制的进化和生殖细胞的形成等方面的保守性和差异性进行探讨(Patel, ’94; Sander, ’94;Tautz et al., ’94; Dequeant and Pourquie, 2008)。
昆虫的胚胎发育根据胚原基图的体节位置以及在原肠胚时期前胚带的体节数可被划分为长胚带昆虫和短胚带/中胚带昆虫。对于长胚带昆虫的生殖细胞，全部体节由早期模式所确定好，然而对于短胚带/中胚带昆虫，后部体节是由第二次生长添加上去的。在长胚带昆虫如果蝇中，按顺序划分的体节基因串联排列，这决定了所有的体节几乎是同时完成的。相反，在短胚带/中胚带昆虫中，后部的体节是由类似于脊椎动物体节发生一样的重复机制一段一段由前向后添加上去的。
但是，这样的划分并不清晰(Sander, ’94)。例如，意蜂在形态学上呈现出长胚带，腹部en的纹路继承了由前向后的体节形成(Fleig, ’90)。对于蜈蚣(Chipman et al., 2004)，体节是由大量细胞持续发育而来而不是由小的胚原细胞。在一些观点中，Peel et al. (2005)更倾向于使用“按顺序体节形成”时期代替“短胚带”时期来描述节肢动物。本文中，昆虫胚的类型被划分为长和短两类，“短胚带”代表“按顺序体节形成”模式。
对于鳞翅目中基于形态学标准被认为是短胚带/中胚带昆虫的烟草天蛾，对控基因runt和体节极性基因wg的表达模式已经被证实。我们发现，全部八条runt纹和全部十六条wg纹均呈现于早期胚胎，这表明全部十六个片段可能显示了原胚层时期。因此，从分子的观点来看，可被划分为长胚带昆虫(Kraft and Ja¨ckle, ’94; Tautz et al., ’94)。对于可呈现出其胚胎发育过程与烟草天蛾相似的另一种鳞翅目昆虫家蚕，体节形成可以通过对控基因eve和runt以及体节极性基因en从分子角度证实(Broadie et al., ’91; Nagy et al., ’94)。这些研究显示，从前部向后部按顺序形成体节的过程可表明，家蚕属于短胚带；然而，对于这一结论，如在组织部位使用原位研究却缺少形态学表现(Xu et al., ’97; Liu et al., 2008)。有趣的是，在受精阶段构建的胚原基分布图中，所有的腹部体节是单独呈现(Myohara, ’94)，并不像通常短胚带昆虫的生长区。这一发现保证了对于家蚕体节形成过程更多的细节研究。这也是揭示生殖细胞分配结构的决定因素。在家蚕中，生殖细胞被认为是散在分布在腹部后部的腹部中线处，而不像普通昆虫位于尾端(Nakao et al., 2008)。这一结论引起了本文对于生物体中的生殖细胞的一些探讨。
在研究中，为了处理这些组织，我使用了全胚胎原位杂交技术再次验证了家蚕从胚胎发育早期直到胚带延伸完全阶段eve和en的表达模式。相似地，我验证了被认为表达在昆虫生长区的cad和wg的表达模式(Nagy and Carrol, ’94; Dearden and Akam, 2001; Copf et al., 2004; Miyawaki et al., 2004; Angelini and Kaufman, 2005;Shinmyo et al., 2005)。在蜘蛛和甲虫中被证实其在后部延伸中起到重要作用(Bolognesi et al., 2008; McGregor et al., 2008)。通过eve也可使用双色探针来研究相关基因的表达。基于以上结论，我们可以讨论家蚕胚胎发育特有的属性，即作为昆虫体节形成的进化特征以及昆虫生殖细胞形成所表现的统一特征。
材料与方法
- 家蚕品种，饲养，发育
实验使用家蚕品系pnd-ps w1。家蚕使用人工饲料（Nippon nosanko）饲养。胚胎发育的条件如Nakao（2008）所描述的。对于早期家蚕发育状况的一般描述参见Nagy et al. (’94)。
- RT-PCR
RT-PCR使用基于Nakao所描述的实验条件。使用GC含量高的PCR试剂盒（BD Biosciences，Palo Alto，CA）如Nakao（2008）描述地进行wg的扩增。对于其他基因，使用高保真性的PCR体系（Roche，Mannheim，Germany）进行扩增。引物的使用，PCR循环以及预期产物的长度如下：wnt1/wg,50-atcggcttcggatttcgctt-30,50-ccacgaacatcgtgtttgtc-30,40 cycles, 544 bp; eve,50-gctggagaaggagttcatga-30,50-cataaaacatggccagcacatc-30, 40 cycles, 510 bp; cad, 50-ggagctcgagaaggaatttc-30, 50-ccgaagtagcgcctatacta-30, 25 cycles, 568 bp.
每一循环保持变性条件为: 951C, 30 sec; 退火条件: 561C,30 sec; 延伸条件: 701C, 90 sec.被每一对引物所包含的基因区域包含有总长超过900bp的内含子，因此，cDNA特异的产物可使用标准琼脂糖凝胶清楚检测出来。
- 原位杂交
固定以及原位杂交的步骤如Nakao（2008）描述地一样。数据库搜索获取杂交探针。使用家蚕基因组数据库(KAIKObase)确定探针序列。EMBL, GenBank, and DDBJ 数据库显示的编码号为P49340的序列是家蚕wnt1/wg编码的蛋白的序列. 使用以上序列即可在KAIKObase中搜索到核酸序列。cad 出现于Xu (’94),
eve，en 出现于Xu (’97). 每一基因相应的PCR 片段得到扩增按顺序克隆转化到pBluescript。杂交所用的核糖核酸探针是这些质粒使用the DIG RNA标记盒(Roche)体外合成的。扩增基因片段所用的引物如下：
eve, 50-ggcttacgataaaaggggttatcag-30, 50-ttagtgctggattgggatagccgta-30;
en, 50-gaaaacaagtgtcgtccgtc-30,50-cttcgattctattgtggtgc-30;
wnt1/wg, 50-cacgtgcaaacggagatgaagcagg-30, 50-cacgtgtgcaccactttttccgtac-30;
cad, 50-atggtgaattacgtcaatccgctcgccatg-30, 50-tcacagtagagggaccggcggtacccctgc-30; twist, 50-gtgtcgctgctgctgtcactggcccctgtt-30, 50-gccgaagctagttgaaatgtacagggccga-30.
结果
RT-PCR表明家蚕基因eve的表达主要是在受精卵中。在胚胎发育之前和开始时仅有微弱的信号能被检测到，此后，表达量会剧烈提升。（Fig.1）早期研究家蚕体节形成是使用eve作为标记的（Xu et al., ’97)。然而，随着对各组织的研究深入，与形态学变化相关的体节形成的时间规律很难描述。为了解决这一问题，实验中通过全胚胎原位杂交手段使用依据家蚕基因组数据库制备的探针进行组织学分析。在产卵后14h，在胚盘中间可观察到eve弱表达区(Fig. 2A)。几小时之后，表达区扩大并占据了大片后部区(Fig. 2B)。随后，成对纹路按照从前致后的顺序从大片的表达区分离出来(Fig. 2C-F)。8条纹路在延伸发生之前即可观察到这一现象(Fig. 2F)。稍早被确认过的按顺序表达的eve纹表明家蚕属于短胚昆虫。早前的研究中，存在的大的后部表达区不可被检测到(Xu et al., ’97)。这也许是由于实验中全胚胎原位杂交技术中信噪比的提升的缘故。
早期研究短胚昆虫时，能够在按顺序表达的eve纹中观察到存在大片表达区(Patel et al., ’94; Mito et al., 2007)。随着对昆虫中cad和wnt1/wg (Xu et al., ‘94)在生长区表达情况的熟知，以及了解到蜘蛛和短胚昆虫中后部延伸具有重要的功能(Nagy and Carrol, ’94; Dearden and Akam, 2001; Copf et al.,2004; Miyawaki et al., 2004 ; Angelini and Kaufman, 2005; Shinmyo et al., 2005; Bolognesi et al., 2008; McGregor et al.,2008),我验证了这些基因在家蚕中的表达模式。RT-PCR表明cad转录是由母体供应的，这可证实先前研究的结论(Xu et al., ‘94)。在此研究中，wnt1/wg 也被发现是由母体供应的(Fig. 1)。在产卵14h时，cad 和wnt1/wg 两者的转录表明在胚盘中除了仅在前部小片区（可能在头部区）未被染色，还存在大片的中部表达区(Fig. 3A, G)。伴随着发育过程，所有的转录都会回缩到后部。然而，wnt1/wg的转录似乎较cad的转录回缩地更快。因次，wnt1/wg的转录总是被观察到存在于cad的表达区内部(Fig. 3B–F, H–L)。这与其他的短胚昆虫基本相似(Nagy and Carrol, ’94; Dearden and Akam, 2001; Copf et al., 2004; Miyawaki et al., 2004; Shinmyo et al.,2005)。使用含eve的双色探针对回缩过程进行更多细节分析作为参考可发现，鉴于cad的转录始终在eve纹显现之后，在wnt1/wg的转录发生回缩后才使得eve纹进行表达(Fig. 4)。从胚带发生形态学变化时开始，体节上的wnt1/wg 纹开始出现在前部。这些纹路与中胚层牙基相对应，阻断了与之临近的中线(Fig. 3I–L, see below)。
最终，eve, cad, wnt1/wg 和en在延伸过程中的表达经证实可决定其持续性以及他们和原肠胚期的关系。综上可知， wnt1/wg 和en 的体节纹路被从中间部位阻断。由使用含有中胚层twist标记的双色探针可得，此阻断作用是源于中胚层牙基的存在(Fig. 5)。发生后部回缩的cad和wnt1/wg 的转录一直持续整个胚带延伸过程(Fig. 6G–L)。在延伸过程中，en纹和体节的wnt1/wg纹相似地按照从前致后的顺序出现(Fig.6D–I)。尽管前部纹路弱于后部纹路，最初时8条eve成对纹可见，之后在延伸过程中从前部起纹路开始褪色(Fig. 6A–C)。Figure 6C显示了几乎整个延伸的胚带，仅有纹路#7 and #8 是添加在尾节的新显现的条纹。当一些en 或wnt1/wg 纹开始形成时原肠胚开始形成，并且在延伸过程中按照从前致后的顺序(Fig. 6D–I)。原肠胚形成较慢，如图Fig. 6E, H所示: 当14条en 和wnt1/wg 纹能够被观察到时, 只有前部2到4节完成了原肠胚。
讨论
- 家蚕体节形成的特点
昆虫分段至少有2类：一类涉及到合胞体环境，另一类涉及细胞间相互作用(Peel et al., 2005)。对于长胚类型的果蝇，按顺序划分的体节基因串联排列在合胞体内，与体节形成几乎是同步的。相反，在像赤拟谷盗（甲虫）的短胚类型中，会像果蝇一样通过扩散作用在合胞体内产生形成素的梯度，后部的体节是在细胞环境下的生长区内从前致后形成的(Schro¨der, 2003)。对于另一种短胚昆虫沙漠蝗（蝗虫），不存在真正的合胞体原肠胚时期，细胞化是在质体进入体周胞质后发生的(Ho et al., ’97)，其形成素的扩散有自己的特点。随着家蚕体节形成，这一昆虫被认为是属于短胚类型。此外，同沙漠蝗相似，家蚕也没有真正的合胞体原肠胚阶段(Takesue et al., ’80; Nagy et al., ’94)。因此，家蚕的体节形成似乎更相似于沙漠蝗这类昆虫。然而，在受精阶段的原基分布图中，家蚕如长胚昆虫一样是唯一具有全部体节的(Myohara, ’94)。的确，如实验所显示的，形成eve纹的几乎全部按顺序形成的体节都没有显著延伸，这表明同蜈蚣一样，其后部存在大量积聚的细胞(Chipman et al.,2004)。起着细胞间通信作用的wnt1/wg和cad共同被认为是在短胚昆虫生长区内表达(Nagy and Carrol, ’94; Dearden and Akam, 2001; Copf et al., 2004; Miyawaki et al., 2004; Angelini and Kaufman, 2005; Shinmyo et al., 2005), 同时表达在大片的胚带后部，即后部体节形成处。wnt1/wg 表达区的功能可能类似于生长区。然而，这可能减慢了家蚕此区内的细胞增殖。事实上，家蚕胚胎原基图上显示的后部区是相较目前为止提到的短胚类型昆虫是扩大的。假定昆虫体节形成是由短胚类型进化到长胚类型，家蚕可能呈现于这一转变的中期。
- 体节按顺序形成
在大部分昆虫中已被证实，体节形成过程是由前致后按顺序形成的，包括家蚕也是如此(Fleig, ’90; Kraft and Ja¨ckle, ’94; Patel et al.,’94; Xu et al., ’97; Pultz et al., ’99; Liu and Kaufman, 2005; Mito et al., 2007; Liu et al., 2008)。在赤拟谷盗中，鉴于验证果蝇成对基因同源物的相互作用以及表达模式，有人提出顺序体节形成机制的模型并提到了机体内主要成对基因的相互作用，指出eve, runt, odd-skipped可周期性大量产生成对纹路(Choe et al., 2006)。所提到的周期性体节形成模型也可能适用于其他昆虫。确实，Liu et al. (2008) 描述了在经RNAi的胚胎中大量截去后部片段可靶向指定家蚕的runt的这一事实似乎符合这一模型。
如文章所提，家蚕与其他短胚类型昆虫其他的相似之处在于，wnt1/wg和 cad在后部表达，wnt1/wg 表达在cad区内。 这些基因已被证实都表达在短胚昆虫的生长区，有证据表明都与体节形成相关(Nagy and Carrol, ’94; Dearden and Akam, 2001; Copf et al., 2004;Miyawaki et al., 2004; Angelini and Kaufman, 2005; Shinmyo et al., 2005; Bolognesi et al., 2008; McGregor et al., 2008)。有人提出可能wg (Miyawaki et al., 2004)和cad(Choe et al., 2006)扮演同样的角色，都是涉及到以上描述的成对基因回路。与所提事实相符的是，wg编码了一种可扩散分子，并且wg可出现并表达在cad表达区内部(Nagy and Carrol, ’94; Dearden and Akam, 2001; Copf et al., 2004; Miyawaki et al., 2004; Shinmyo et al., 2005)。家蚕中涉及到体节形成的这些基因有可能是相似的。也许，在家蚕中获得的结果显示，体节出现于wnt1/wg回缩之后，同时cad表达区覆盖了之前体节的形成，预示着wnt1/wg在家蚕体节形成中的功能更直接而不需通过cad起作用。有趣的是，这些结果让人联想到脊椎动物体节发生模式的时间点和波纹(Dequeant and Pourquie, 2008)。
确实，在家蚕中，包括cad和wnt1/wg 开始时都表现大量的中部表达区，随着体节的形成，稍后会回缩至后部。这是家蚕所特有的。然而，当家蚕体节形成中细胞增殖有所减慢时这一差异可以缓减: 目前为止在短胚昆虫中已被证实，生长区的生长功能可迫使细胞显著于静置的cad/wnt1/wg 区, 同时在家蚕中cad/wnt1/wg区的回缩也是起到了相同的作用。
- 原肠胚
原肠胚时期和体节形成时期两者之间的关系依昆虫而不同。这被用来划分胚的种类。对于长胚类型如果蝇，原肠胚始于原胚层阶段，此时全部分段都被划分好，分段几乎沿着前后轴同步进行。相反，对于短胚类型如赤拟谷盗和沙漠蝗，原肠胚形成在胚的初期，此时按照en或 wg的表达，少数体节被划分好。在赤拟谷盗中，原肠胚被认为是由后致前形成的(Roth, 2004; Handel et al., 2005)。相比之下，如文章中提到的，家蚕原肠胚开始于胚带延伸阶段的后期，此时一些体节已被划分好，随后在体节被划分之后的长时间内，缓慢地按照顺序由前致后形成体节。家蚕原肠胚的这些特点与其独特的体节形成有关，如文章所描述一样，非常有趣。
- 家蚕生殖细胞的特点
和果蝇一样，家蚕的生殖细胞的形成被认为是由自身的细胞质决定的(Extavour, 2003; Nakao et al., 2008)。使人迷惑的是，如文章所描述的，家蚕生殖细胞出现的位置与果蝇和赤拟谷盗这些生殖细胞起源于尾端的昆虫是不同的。 本文有力证明了这些昆虫生殖细胞的出现位置是与其身体体节的划分有关的。确实，在果蝇和赤拟谷盗中，身体的体节形成对于尾端的位置是有影响的。果蝇的体节对尾节和最后一节腹部体节进行了划分。赤拟谷盗则是划分了生殖细胞在生长区的位置(Sprenger and Nu¨ sslein-Volhard, ’93; Schro¨der et al., 2000; Schoppmeier and Schro¨der, 2005; Schro¨der, 2006)。在家蚕中，生殖细胞的出现位置与按顺序形成的体节是相对应的。家蚕的身体体节系统划分出其生长区，这与果蝇和赤拟谷盗的身体尾部的划分是不同的。
Figure 1. 此图显示胚胎早期使用RT-PCR分析家蚕eve, cad, and wnt1/wg的表达。RT-PCR 使用卵巢以及0, 14, and 24 hr的胚胎 poly(A)1 RNA作为模板.。扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳分析。M表示100bp梯度的DNA分子标记。箭头显示600bp标记带的位置。
Figure 2. 此图显示的是使用全胚胎原位杂交显示出早期胚胎阶段家蚕eve表达的时间进程。 (A) 产卵后14hr , (B)产卵后17 hr , (C) 产卵后20 hr , (D) 产卵后21–22 hr , (E) 产卵后24 hr , (F) 产卵后25 hr 。 前端在左侧。除图E外全为腹面图。 (E)为侧面图。腹面朝上。如其他昆虫中所观察到的，成对的eve 纹从大片后部区分隔开(B–D)。几乎所有可观察到的胚带延伸发生之前的纹路(E, F)都是家蚕特有的
Figure 3. 此图显示的是使用全胚胎原位杂交显示出早期胚胎阶段家蚕eve和wnt1/wg表达的时间进程。(A–F) cad, (G–L) wnt1/wg, (A, G) 产卵后14 hr, (B, H) 产卵后17 hr , (C, I) 产卵后19 hr , (D, J) 产卵后21 hr , (E, K) 产卵后23 hr , (F, L) 产卵后25 hr . 前端在左侧。均为腹面图。每张图片显示的是结合有卵黄的胚胎。白色和蓝色箭头可粗略显示胚带前部和后部的边界位置。cad 和wnt1/wg都是起始占据大片后部区域(A, G)稍后缩回后部。
Figure 4.使用双色原位杂交同步检测家蚕胚胎基因的表达情况。(A, B) eve (蓝色),
cad (红色)。均为腹面图。(C, D) eve (蓝色), wnt1/wg (红色)。均为侧面图，腹侧朝上。 (A, C) 产卵后19–20 hr ,。(B) 产卵后23–24 hr 。(D) 产卵后21–22 hr ，前部在左侧。 (B)处红色箭头显示cad表达区的前部界限。体节形成过程和cad以及wnt1/wg一样会发生回缩。体节形成和wnt1/wg区的回缩相对应：eve纹显示于wnt1/wg表达终止之后(C, D), 此时cad 区覆盖一些eve纹 (A, B)。
Figure 5. 用en 和 twist探针同时标记家蚕胚带。通过twist（红色）表达可显示出，中胚层时en (蓝色) 纹路从中间被截断。
Figure 6. 此图显示的是家蚕胚带延伸时eve, en, wnt1/wg, cad 的表达情况。 (A–C) eve, (D–F) en, (G–I) wnt1/wg, (J–L) cad, (A,D, G, J) 产卵后27 hr , (B, E, H, K) 产卵后29 hr , (C, F, I, L) 产卵后30 hr 。这些发育时期都有相似的值。(C)图可见成对eve纹。(C) 图还可显示eve在尾节有表达。eve 纹在体节形成过程中从前部区开始逐渐变浅[将 (A–C) 与 (D–F) 或 (G–I)相比]。en 和 wnt1/wg 显色表明，像短胚昆虫一样，超过体节界限的部分也都是按顺序被划分好的(D–F, G–I)。在体节被划分好后一长段时间内，家蚕原肠胚由前致后形成(D–F, G–I)。