小鼠单克隆抗体制备

小鼠单克隆抗体制备

一、杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理[1]

     单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

      把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能，这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。

二、单克隆抗体的制备过程[2]

2.1实验动物的免疫

（1）首免乳化：取抗原（150-200μg/只）与等体积的弗氏完全佐剂混合，通过医用三通管和注射器进行反复推打乳化，一般要求达到乳化后的混合物滴到水面能保持滴状，不迅速扩散为止。

（2）首免注射：采用多点注射法，注射部位优先选择四肢皮下、腋下，而后选择背部注射。

（3）后续免疫：取抗原（80-100μg/只）与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化过程、免疫注射过程与首免完全一致。

（4）四免后尾部静脉采血，以血清为一抗进行间接ELISA测定小鼠血清效价，当血清稀释倍数为12800时，OD值≥1即可判定为满足融合标准。

（5）冲刺免疫：取抗原原液（200-250μg/只），直接进行腹腔注射，3-5天后即可进行细胞融合。

2.2细胞融合

（1）用1640不完全培养基将SP2/0细胞和免疫鼠脾细胞重悬，分别用血球计数板计数，按脾细胞：SP2/0细胞=1:3比例于50ml无菌离心管中混合，充分混合后加1640不完全培养基至40ml；

（2）1500rpm离心5min。（此时准备37℃的温水用于细胞融合离心管的温育）

（3）离心后弃上清以及管壁液体（可用灭菌吸水纸条吸干），轻轻敲打SP2/0细胞和免疫鼠细胞混合沉淀使其松动，将离心管底部浸入37℃温水中。

（4）从培养箱中取出已温育的1ml融合剂PEG1450，60s内均匀滴入细胞混合沉淀中（边滴加边转动离心管）。

（5）静置温育45s，取出37℃温箱中预热的1640不完全培养基，取1ml，60s均匀滴入沉淀中稀释PEG融合剂（边滴加边转动离心管），再取1ml，30s内均匀滴入，之后将剩余的45ml培养基全部慢慢滴入。

2.3免疫小鼠血清效价测定

（1）在进行4次免疫后，对小鼠进行尾部静脉采血。

（2）采集的小鼠全血置于37℃ 1 h，再4℃ 1小时，亦可4℃放置过夜，随后3000-4000 rpm 离心5-10 min，取上清置于新的干净的EP管内，即为免疫小鼠血清。

（3）随机选用一只小鼠的血清进行棋盘法最佳包被浓度的测定，抗原包被浓度梯度通常设置0.25-10μg/ml，血清稀释倍数常用400倍或者500倍稀释作为起始稀释倍数。

（4）通过间接ELISA测定OD450nm，将结果制成折线统计图，通过观察折线图的起始点判定：当起始点的OD450nm值不再随包被抗原浓度的增加而明显的上升，且整条折线呈较平滑的下降趋势，该包被浓度即为最佳包被浓度。

（5）以最佳包被浓度测定其他小鼠的血清效价，当血清稀释倍数在12800倍时，OD450nm值≥1.0，即可判定为满足融合要求。

三、单克隆抗体的优势和局限性[3]

     单克隆抗体的优点：（1）杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。（2）可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。（3）由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。（4）由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。

      单克隆抗体的局限性：（1）单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。（2）单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。（3）制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。

四、单克隆抗体的应用[3]

1．检验医学诊断试剂

      作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。

2．蛋白质的提纯

     单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。

3．肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术

       将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。单克隆抗体主要为鼠源性抗体，异种动物血清可引起人体过敏反应。因此，制备人-人单克隆抗体或人源化抗体更为重要，但此方面仍未取得明显进展。

       卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)多年来致力于抗体制备研究。单克隆抗体是由激活的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合而成的单克隆杂交瘤细胞产生的。我们拥有经验丰富的抗体制备技术人员，积累了充足的抗体制备经验和专业技术，配合完善的抗体生产设备，能够为客户提供不同物种的单克隆抗体定制服务。

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2. M.-G B , Roy R .Simultaneous binding of mouse monoclonal antibody and streptavidin to heterobifunctional dendritic l-lysine core bearing T-antigen tumor marker and biotin - ScienceDirect[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2001, 9(11):3005-3011.
3. Qi,L,Lu,et al.A New Blocking Method for Application of Murine Monoclonal Antibody to Mouse Tissue Sections[J].Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 2016.