癌症

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  DNA双链断裂及其对基因组不稳定性和癌症的影响
  乔治·伊利阿克斯, 埃米尔·姆拉德诺夫和维罗妮卡·姆拉德诺娃

杜伊斯堡-埃森大学医学院医学放射生物学研究所，德国埃森45122； [email protected]（E.M.）;
[email protected]（V.M.）
通讯：[email protected]；
电话：+ 49-201-723-4152
收到：2019年9月26日;
接受：2019年10月24日;
发布时间：2019年10月28日

• 摘要:

       将细胞暴露于电离辐射（IR）后，DNA中会诱导双链断裂（DSB），这对基因组完整性非常重要，需要高度专业化的加工模式。 DSB的错误处理是导致细胞死亡或将其转化为癌细胞的原因。在高等真核生物的细胞中已经进化出了四种机制不同的途径来处理DSB，从而为受损细胞提供了多种选择。同源重组修复
（HRR）依赖的基因转换地铁（GC）以无错误的方式从基因组中去除了IR诱导的DSB。经典的非同源末端连接（c-NHEJ）可以非常快的速度除去DSB，但无法恢复产生的连接处的序列，并且可以催化易位的形成。备选末端连接（alt-EJ）的操作原理与c-NHEJ相似，但在序列保留和易位形成方面更慢且更容易出错。最后，单链退火（SSA）与大量缺失相关，也可能形成易位。因此，可用于处理DSB的四种途径不是产生同等结果的替代选择。我们讨论了具有如此不同的属性和保真度的路径进化的原理，并概述了控制它们参与的逻辑和必要性。我们认为，细胞不能自由选择一种特定的途径来处理DSB，而是通过应用最高保真度选择的逻辑来参与一种途径，该逻辑适用于所处理的DSB的特性所强加的必要性。我们介绍了DSB簇作为染色质破坏的一种特殊后果形式，并审查了发现，表明这种形式的破坏为高线性能量转移（LET）辐射方式的功效增强奠定了基础。提出的概念对保护人类免受ra诱发的癌症以及用高LET辐射治疗癌症具有重要意义。
关键字：DNA修复； 双链断裂（DSB）； 同源重组修复（HRR）; 基因转换（GC）; c-NHEJ； alt-EJ; 单链退火（SSA）； 电离辐射（IR）； 复杂的DSB； 高LET辐射

1. 简介：DSB修复路径使用的一般注意事项

        癌症与染色体易位的形成有着千丝万缕的联系，染色体易位是基因组不稳定性的最主要表现之一，是该疾病发展的基础[1-3]。 染色体易位是细胞中产生的DNA双链断裂（DSB）错误处理的直接结果，这是DNA复制过程中或减数分裂中编程事件或免疫系统发育和成熟过程中出现问题的结果。 由于细胞暴露于各种破坏DNA的化学和物理因素，DSB也直接或间接产生。
        众所周知，DSBs在脊椎动物中代表着特别危险的DNA损伤，因为它们直接破坏了DNA分子的完整性，并产生了一种基本概念演变为修复其他形式的DNA损伤的条件[4-7]。 这是因为DSB会影响两条DNA链，并损害了修复限于一条链的损伤所用的关键原理：用作互补，未损坏链的模板以恢复受损链的序列和完整性[8]。
        DSB的这一特性使人们期望它们的处理将是有问题的，因此效率低下且速度慢。 然而，令人惊讶的是，过去30年中进行的工作证明了一种令人印象深刻的DSB处理系统，它具有非凡的总修复能力，包括多个修复路径，其中一些以非常高的速度运行[4-7]。 这种DSB处理系统可确保细胞中绝大多数由物理试剂（如电离辐射）诱导的DSB。
（IR）以及各种化学物质的处理速度通常比局限于一条DNA链的DNA损伤要快。
        尽管DSB处理系统具有这些明显的令人印象深刻的特征，但DSB诱导仍然是高风险事件，长期以来描述的IR有害影响：点突变以及基因组重排会导致细胞死亡和最显着的癌症[ 9]。 由于DNA损伤固有的DSB严重性，进化出了高度复杂的细胞反应网络，当细胞在其基因组中检测到DSB时，该网络会立即被激活。 这种所谓的“ DNA损伤反应（DDR）” [10]仅起源于DSB（和单链DNA区域），调节几乎修饰细胞每一种代谢活性的过程，并为加工，适应或 程序性细胞死亡。
        最近对DDR和DSB修复进行的深入分析得到的高度结论性认识是，上述有效的整体DSB处理是通过多种途径的协作实现的，这些途径具有非常不同的操作要求，并且令人惊讶地产生了不等效的结果[4] –7]。 这对于DSB处理而言是非常独特的，因为替代途径通常以或多或少等效的方式执行生物过程，并以不同的方式达到相同的最终结果。
        相比之下，对于DSB处理，尽管所有特征性途径都可以消除DNA的物理断裂，但它们在恢复DSB附近原始序列方面的准确性差异很大，有时甚至连错了DNA末端， 引起易位。
        演化出四种不同的途径来处理DSB。 基于同源重组（HR）修复的途径，即基因转化（GC），是唯一能够恢复DNA完整性和原始DNA序列的无错误途径。 经典的非同源末端连接（c-NHEJ），替代末端连接（alt-EJ）和单链退火（SSA）是另一种依赖HR的途径，可从基因组中去除断裂，但会导致突变，缺失， 由于其机械基础所固有的功能特性而导致的易位和易位，将在以下部分[4-7]中进行描述。 因此，这些途径不是处理定义明确的DNA损伤，实现定义明确的目标的替代方法：完全恢复基因组。 相反，正如我们将在下面看到的，它们的进化表明它们可用于处理不同形式的DNA断裂。 接受降低的结果精度以实现DSB去除，从而达到一线基因组完整性，
当DSB处理出现困难时。
        指导我们研究活动的有效假设是，DSB修复途径参与的关键参数是DSB在基因组中产生的染色质不稳定程度。 我们假设这种染色质去稳定作用以不同的方式影响每个DSB加工途径。
        已经确定了可能确定由DSB产生的染色质去稳定程度的几个参数，目前正在深入研究以确定它们对DSB处理的贡献。 因此，常染色质中产生的DSB可能与异染色质中产生的DSB具有不同的结果。 即使在常染色质中，在基因组的活跃转录区域中产生的DSB也可能高度不稳定。 同样，在活跃的DNA复制区域产生的DSB将产生明显的染色质不稳定，并可能破坏复制叉。
        此外，染色质在细胞周期的每个阶段都是高度动态的，当细胞从细胞周期的一个阶段过渡到下一阶段时，染色质会发生剧烈变化。 当细胞进入有丝分裂时，以及当细胞进入G1期时，在有丝分裂完成后，染色质组织的变化最为显着。 因此，在有丝分裂之前或期间诱导的DSB可能会产生严重的染色质不稳定现象，这一点已被以下观察充分证明：有丝分裂是细胞周期中最敏感的放射阶段[11]。
        在IR的情况下，生成的DSB的形式为染色质组织和活性的上述方面增加了另一层次的复杂性和全新的参数集[4]。与限制性核酸内切酶诱导的DSB形成鲜明对比的是，IR产生了不同形式的DSB，它们的染色质去稳定潜力大不相同。这是因为IR通过撞击和破坏两条DNA链的电离簇生成DSB。一个电离簇可能包含两个电离，但也可能包含更多（图1）。根据电离的次数，DNA不仅可能被断裂，而且在断裂附近的多个位置被破坏，从而产生所谓的“复杂”损伤（见下文）。由于蛋白质加工碱基损伤和单链断裂平行募集到DSB位点的结果，DSB附近这种额外DNA损伤的积累可能会增加染色质的局部不稳定。已经描述了病变复杂度的其他级别，并将在以下各节中详细讨论

图 1.png

图1.低LET或高LETα粒子的电子在含DNA的空间中产生的电离分布。 请注意，高LET粒子会增加电离密度。 当电离事件同时破坏两条DNA链时，就会生成DSB。 为简单起见，该示意图仅考虑了直接的IR效应，即直接发生在DNA上的电离。 然而，DNA中间接产生的破坏（间接作用）对于IR的整体作用也很重要，即，当DNA附近的水分子被电离时所产生的自由基。 此类事件增加了引发DSB的事件的复杂性，但并没有从根本上改变此处提出的原理。 间接效应对整体效应的贡献随着所用辐射的LET的增加而下降。
       我们假设DSB的染色质不稳定程度将由上述概述的物理和生物学参数确定，染色质的不稳定程度进而将决定参与该DSB加工的途径。 所有可用的信息表明，该集成处理系统的主要目标是不处理任何DSB，并且通过将DNA末端（即使在基因组上不一致）连接在一起也可以实现这一壮举。 尽管这个目标是以改变和破坏整个基因组的事件为代价的，例如DNA序列改变，核苷酸丢失和易位，但这种结果显然比高保真处理机制留下的断裂基因组更可取 在DSB的染色质环境中失败。
        按照这种推理，未修复的DSB或在完成批量DSB处理后检测到的DNA末端，反映了未能将两个DNA末端彼此靠近并连接在一起的失败。 这个概念也解释了为什么高等真核生物很大程度上依赖于简单地将DNA末端连接在一起的途径，而与它们的来源无关（c-NHEJ，alt-EJ），而较少地（至少显然）依赖于更复杂但无错误的过程，例如GC 就像酵母和细菌一样！
        实际上，可以将末端连接途径主要且更适当地视为DNA末端管理/清除系统，而不是真正的修复机制，其设计是通过将DNA末端聚集在一起并将它们彼此结合而从基因组中除去DNA末端。 它们实际上可能反映了进化中的晚期事件，这些事件有助于管理规模不断扩大的基因组的完整性。 因此，导致细胞死亡和癌症的致命事件可能是在处理特定DSB的特定途径参与过程中“考虑在内”的事故。
        考虑到所有上述信息，我们建议特定DSB处理路径的参与是由必要性而非选择决定的。 我们的工作假设是，原则上必须对细胞进行进化编程，使其首先使用具有恢复完整基因组的最大可能性的DSB处理途径，但如果破裂部位的染色质状态产生条件，它们也将自适应地招募较低保真度的选择。 危及这条路。 必要性的概念建议了DSB处理中的层次结构，首先会询问最高保真度的路径。 仅当先前的较高保真度路径在现有染色质组织和活性的情况下失败时，才会依次询问降低保真度的路径。 “最后手段”途径将把任何DNA末端放在一起，包括那些属于不同染色质区域甚至是不同染色体的末端。
        假设在去除DSB时对现有DSB处理途径进行这种分层询问，以反映其进化过程中的内在逻辑，目的是在适应现实后最大程度地保存遗传信息。 这也意味着该细胞不是在四个修复途径之一中“选择”，而是将上述“逻辑”应用于每个DSB，并且总是在这种情况下使用最佳途径。
        下面，我们总结了DSB处理路径的关键特征，以说明上述概念的基础，并回顾了实验结果，这些实验描述了如何使用这些概念和假设来理解DSB复杂度在处理路径参与中的作用。 我们将说明增加的LET的辐射模态如何导致复杂性增加的DSB，并表明增加的DSB复杂性会损害c-NHEJ对DSB的一个尚未定义子集的DSB处理。 最后，我们将利用此特性在定义的生物学模型中验证一种复杂性DSB簇，它是支持高LET辐射功效增强的关键病变之一。

2.处理DSB的途径的特征

2.1. 一般注意事项
        如上所述，DSB处理设备最吸引人的特征是它集成了四个路径，每个路径都使用不同的分子机制处理DSB（图2）。在上述基本原理的棱镜下可以看到，这种机械的机制赋予细胞多种选择，以处理在染色质中产生不同程度的不稳定的DSB。结果，这四个途径没有反映出可以随机选择的结余等效DSB的备选方案。因此，我们将避免使用术语“ DSB修复途径选择”来避免印象，即细胞可自由参与所有DSB的四个途径中的任何一个，而与形式，染色质的定位或染色质的持续活性无关。我们将尝试表明，在处理任何给定DSB的过程中，路径选择实际上只有有限的自由度。接下来，我们概述了四种DSB修复途径及其操作对基因组完整性的影响，并合理地说明了为什么我们根据需要推测其分层参与的原因。
2.2. c-NHEJ快速去除DNA末端
        通常，由IR产生的DSB具有平末端或包含非常短的突出单链DNA末端[4]。 C-NHEJ通过将它们连接在一起，以这种方式事实上地去除了DSB，从而在从基因组中去除此类DNA末端方面非常高效。 C-NHEJ从KU70 / KU80异二聚体（KU）与DNA末端的快速和令人印象深刻的牢固结合开始，介导立即依赖大的DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）募集形成活性DNA-PK 全酶[4-7,12,13]（图2）。 由于其很大的尺寸，DNA-PK全酶被认为可以作为c-NHEJ其他成分的募集支架，并且其激酶活性通过磷酸化包括自身在内的几种蛋白质来调节该过程。

图2.png

图2.（a）通过不依赖DNA末端切除和依赖DNA末端切除的DSB修复途径修复DSB。 经典的非同源末端连接（c-NHEJ）由KU异二聚体的强结合和DNA-PKcs蛋白激酶的募集引发，这被认为可以阻断和减弱依赖DNA末端切除的DSB加工。 基因转化（GC），单链退火（SSA）和替代末端连接（alt-EJ）由精确控制的DNA末端切除启动。 只有GC才能忠实还原DSB周围的DNA序列。 所有其余的DSB修复途径均容易出错，并具有基因组改变的特征。 本文讨论了不同DSB修复途径不同特征的可能后果及其易错性质的重要性。 （b）上述DSB处理途径对细胞周期依赖性的概述。 在通过LIG4 / XRCC4 / XLF / PAXX复合体连接之前，每个DNA末端都需要 “清洗”以启用结扎。 这是因为IR通过破坏末端核苷酸的糖部分破坏了DNA，而末端核苷酸的残基需要去除。 该处理过程利用了Artemis，Aprataxin和 安普他新和PNK样因子（APLF）。 X家族DNA聚合酶成员Polλ和Pol µ进行的DNA合成，填补了DNA中的缺口，并以非互补的方式添加了新的核苷酸，最终完成了DNA分子的还原[12,14]。
        c-NHEJ分子装置高效运行。借助催化反应的简单性和细胞中大量KU和DNA-PKcs分子的辅助，它以无与伦比的速度以独立于细胞周期的方式从基因组中去除DNA末端[4]。的确，c-NHEJ的运行速度比处理局限于一个DNA链的基础病变的许多修复途径要快[4]。但是，c-NHEJ会连接任何碰巧接近的DNA末端，即它没有内置机制可确保原始DNA末端的连接。结果，c-NHEJ可以催化易位的形成[15,16]。但是，其非凡的速度以及通过红外生成DSB时，两个同源DNA末端在空间上彼此非常接近，因此c-NHEJ经常会连接“正确”末端，从而抑制了易位形成。因此，由c-NHEJ催化的易位形成可能涉及DNA末端，这些末端分开并与不相关的类似漂移的DNA末端重新结合。此外，从分子结构上可以明显看出，当同源末端重新连接时，c-NHEJ没有内置机制可恢复DSB连接处的DNA序列，并且经常观察到核苷酸的添加或缺失（图2）。然而，c-NHEJ介导的DNA序列改变很小，仅涉及少数核苷酸的缺失或添加[4-7,12,13]。
        总之，c-NHEJ是一种监视机制，一旦它们在空间上彼此靠近，就可以通过成对地将它们配对快速清除DNA末端。 因此，它使基因组没有DNA末端，从而提高了其稳定性。 由上面概述的c-NHEJ分子特征产生的难题是，剩余的三个DSB处理途径如何在c-NHEJ熟练的背景下与DSB结合，以及为什么细胞明显偏爱基本易错的途径。 下面，我们介绍了损害c-NHEJ并促进其余DSB处理途径利用的DSB形式。
2.3. 通过GC，SSA和Alt-EJ进行DNA末端切除相关的DSB重新结合
        未通过c-NHEJ从基因组中去除的DSB末端准备通过三种替代途径进行加工，尽管途径不同，但所有途径均始于每个DNA末端50链的核酸外切降解，从而产生30条-单链DNA（ssDNA），其反应称为DNA末端切除（图2）。 DNA末端切除具有双重目的：首先，它有助于从KU中释放DNA末端，而KU对ssDNA的亲和力非常低。其次，它启动了下面将要描述的DSB处理的替代模式[13,17]。 DNA末端切除尤其利用了MRE11 / RAD50 / NBS1（MRN）复合物（）以及CtBP相互作用蛋白（CtIP），核酸外切酶1（EXO1），DNA复制解旋酶/核酸酶2（DNA2）的活性）和布卢姆综合症（BLM）解旋酶，并产生具有30个突出端的ssDNA，并由复制蛋白A（RPA）稳定。此结构随后启动GC，SSA或alt-EJ。在整个细胞周期中，切除均受到多个级别的严格调节，这对DSB处理的所有依赖切除的途径都产生了强烈的细胞周期依赖性[18]。
2.3.1. 基因转换（GC）
        GC的最显着特征是它需要姐妹染色单体形式的同源模板[19-22]。在GC期间，上面描述的DNA末端切除反应会从两个DNA末端去除几千个碱基对，以产生同样长的30 ssDNA链，并通过RPA进行稳定。 RPA在RAD51旁系同源物（RAD51B，RAD51C，RAD51D，XRCC2和XRCC3）和BRCA2的促进下的反应中由RAD51交换[19-21]。 RAD51核蛋白丝随后侵入并退火到姐妹染色单体的同源区域，形成称为霍利迪结（HJ）的结构，并通过RAD54辅助的模板化DNA合成扩展了30末端。在DNA复制完成后不久，通过加载粘着蛋白，姐妹染色单体之间的空间接近性极大地促进了RAD51包被的ssDNA的同源性搜索，并降低了DNA末端的自由度，从而降低了它们漂移的可能性。在HJ形成和DNA合成开始之后，并且取决于第二个DNA末端是否被类似地捕获以形成双HJ，反应可以沿着不同的路径继续进行，其详细描述超出了本文的范围。但是，在IR诱导的DSB的情况下，最可能的情况是HJ在延伸后被解析，释放的ssDNA退火与另一DNA的末端类似的末端ssDNA退火，从而重新构建了一个dsDNA分子，其缺口为填充并最终连接以完全恢复DNA分子[19-21]。
        上述机制的约束条件确保将DSB的原始端排他地结合在一起。 此外，同一姐妹染色单体上的模板化DNA合成使GC能够忠实地还原DSB附近的DNA序列。 结果，GC以无错误的方式运行，而不会引起细胞基因组中的易位或序列修饰（图2）。 另一方面，GC只能在复制后发生，部分在细胞周期的S期发生，而在G2阶段完全发生[18]。 另外，所涉及的步骤数量，特别是入侵步骤，表明GC将是一个相对较慢的过程。
2.3.2. 单链退火（SSA)
        SSA也是DSB处理的同源性依赖途径[22-25]。 但是，与仅依赖于姐妹染色单体中发现的同源性的GC相反，SSA通常利用同一DNA分子中存在的同源区域。 在SSA期间，DNA末端的切除可能比GC切除后延伸得更多，有时取决于侧翼同源性之间的距离，达到数十万个碱基对。 值得注意的是，人类基因组中大量重复序列为SSA的结合提供了同源性。 然而，对IR诱导的DSB处理中SSA参与水平的系统分析只是最近才开始系统地进行分析[24]。
        与HRR相比，SSA不需要RAD51，而是使用链退火蛋白RAD52来退火DSB侧翼同源DNA序列，因为它们在DNA末端切除后就暴露了[22-25]。 SSA总是与DNA片段的缺失有关，该DNA片段由所利用的同源性区域限定。结果，还需要去除同源区域退火后形成的ssDNA瓣。 XPF–ERCC1和MSH2–MSH3复合物提供此功能，然后进行DNA连接以恢复DNA分子的完整性。 SSA由于其产生的大量删除而极易出错，并且在伙伴选择中可能是混杂的，从而形成易位[22]。但是，当SSA在复制后进行操作时，粘着蛋白介导的稳定作用有望减少DNA末端的漂移，从而减少易位的形成。因此，尽管使用了同源性，SSA还是一个容易出错的DSB处理途径，并且切除的要求使其在S期和G2期具有细胞周期依赖性并具有最大活性。
2.3.3. 替代端接（Alt-EJ）
        Alt-EJ的操作原理与c-NHEJ相似，只是将两个DNA末端连接在一起[4,12,26,27]。 但是，与c-NHEJ相比，alt-EJ通常受益于暴露微同源性的DNA末端切除。 这些微同源性通常小于10个碱基对，并且可以帮助两个切除的DNA末端之间的退火，从而促进它们的结合。 这种特性证明了该途径的替代名称是微同源介导的末端连接（MMEJ）[28,29]。 但是，尚未正式证明IR诱导的DSB的所有加工都需要切除DNA末端，很可能DNA末端的一部分被alt-EJ处理而无法进行可切除的切除。
        除上述切除蛋白外，牵连alt-EJ的蛋白通常不专门用于该途径，并且也参与DNA代谢的其他方面。例如，聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP-1）促进alt-EJ，但在细胞中还具有许多其他功能[4,12,26,27]。 alt-EJ的一个相当新的蛋白质是Polθ，它是一种A族DNA聚合酶，由POLQ基因编码[30-32]。 Polθ具有一个C端聚合酶结构域，以及一个N端解旋酶样结构域，即使两个同源性很小的30 ssDNA突出端也能稳定退火。在以这种方式生成的结构中，Polθ的聚合酶活性以退火伴侣为模板延伸至30末端[31]。 alt-EJ的最终连接步骤是由DNA连接酶I和III（LIG1和LIG3）介导的，而连接子组蛋白H1可能是对齐因子[4]。尽管alt-EJ在整个细胞周期中都活跃[25-27]，但它显示出强烈的细胞周期依赖性活性波动，G2期最大，而G1活性降低，这是由于其对DNA末端切除的依赖性[27] ]。实际上，alt-EJ通常在静止的G0细胞中被消融[33-35]。
        与c-NHEJ相似，alt-EJ可以独立于来源连接任何DNA末端。 但是，由于它的动力学比c-NHEJ慢，并且是由协调性低得多的装置完成的，因此DNA末端漂移的可能性更大，因此也有形成易位的可能性。 Alt-EJ也没有内置机制来恢复DSB连接处的DNA序列。 这个事实，加上经常需要的DNA末端切除，增加了连接处的缺失和其他序列改变的频率。 实际上，基因组中的这些变化比c-NHEJ产生的变化要广泛得多。
        总体而言，以上概述表明只有GC以无错误的方式运行。 所有其余的DSB处理途径都容易出错，并且原则上都可以促进染色体易位的形成和DSB连接处的序列改变。 下面我们介绍合理化具有这种多样性的修复途径进化的结果。

3. IR诱导了不同复杂度的DSB

        如上所述，当在DNA附近产生电离簇时，DSB在受辐照的细胞中形成少数损伤[36,37]，同时破坏了几个核苷酸内多个位置的分子（图1）。 IR可以是光子的形式，例如X射线或γ射线，也可以是高能粒子的形式-从电子，质子或中子到像铀一样大的核。辐射生物学的一个早期关键发现是不同形式的IR会产生广泛不同的生物学效应[38]。这在图3中进行了说明，图3显示了通过评估细胞形成集落的能力来衡量的细胞存活率，该能力是辐射剂量的函数；对于许多其他端点，已经确认了类似的响应。显然，56Fe +离子比X射线更有效地杀死M059K细胞。由于在相同剂量的不同辐射模态下会产生相似数量的电离[37,39–41]，因此必须使用附加参数来增强alpha粒子和其他高LET辐射模态的有效性。一个这样的参数是LET（线性能量转移），它描述了每单位粒子轨道长度穿过细胞时所传递的能量（以及由此产生的电离）（图1）。辐射的LET越高，在任何给定剂量下簇离子化事件的比例越高。
        由于电离簇的增加会增加DSB诱导的可能性，因此首先假设高LET辐射的功效增加是由于DSB诱导的增加所致。 然而，令人惊讶的是，对该假设进行了广泛的研究，结果表明，尽管还报道了中间碎片的增加，但每单位剂量的不同LET的辐射模态产生的DSB数量相似[42-48]（图4a）。

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图3.（a）暴露于低LET（x射线）和高LET（56Fe +离子，LET = 151 keV / µm）的DNA-PKcs熟练（M059K）和DNA-PKcs缺陷（M059J）细胞的代表性存活实验。 请注意，与DNA-PKcs缺陷相关的c-NHEJ缺陷消除了野生型细胞所观察到的LET依赖性放射致敏作用。 这里描述的结果是从Singh等人重新得出的。 以说明本次审查中开发的概念。 （b）使用XRCC2缺陷的V79 irs1突变体（在GC中产生强烈缺陷）获得了相似的结果。 显示的结果可追溯到Hill等人。

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图4.暴露于X射线和56Fe +离子（LET 151 keV / µm）的c-NHEJ缺陷（M059K）和c-NHEJ缺陷（M059J）细胞的脉冲场凝胶电泳（PFGE）实验。 （a）暴露于低或高LET IR下的M059K和M059J细胞的剂量反应曲线。 请注意，DSB的诱导不受LET或c-NHEJ中的缺陷的影响。 （b）暴露于低或高LET IR下的M059K和M059J细胞的修复动力学。 请注意，尽管存在细微的差异，但c-NHEJ高效和不足的细胞在暴露于高LET IR或低LET IR后仍能主动修复DSB。
        这些结果导致了后续的假设，即高LET辐射在生物学上更有效，因为它们产生了细胞难以处理的更复杂的DSB [36,50-53]。由于基于复杂性的DSB生物学相关分类仍然难以捉摸，因此我们尝试根据DSB包含的损害数量对其进行分类[4]（图5）。在这种分类中，DSB的最简单形式是限制性核酸内切酶（RE）[4]产生的一种形式，该酶可断裂DNA而不会化学改变其核苷酸。另一方面，IR通过化学改变核苷酸来诱导DSB：以最简单的形式，IR诱导的DSB通过破坏糖-磷酸骨架的糖来破坏DNA，并经常生成30损坏的糖，其形式为磷酸乙醇酸和50 -OH必须在末端连接[54,55]之前除去（参见上文）（图5）。因此，这些DSB被认为比RE诱导的DSB更复杂。当DSB的一个螺旋圈内出现其他形式的损坏，例如基础损坏或单链断裂时，会进一步增加复杂性[56]。已经发现这种形式的复杂性随LET的增加而增加，因此经常被用来解释增强的生物学效应。假设是，在这种形式的DSB中，这种非DSB损伤会阻碍加工，这些非DSB损伤会在DSB加工途径的功能中产生障碍，并且还会使该部位的染色质不稳定。
        经常被认为可以解释高LET辐射增强功效的另一种复杂形式是DSB簇（图5）。 DSB簇可能对染色质高度不稳定，并且这种不稳定与染色质位置和染色质活性一起可能严重损害其忠实的修复[4]。 数学模型表明，高LET IR的物理特征增加了DSB团簇诱导的可能性，从而解释了高LET IR的功效增加[4,56]。

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图5.根据DSB的复杂程度进行分类的概念。由REs产生的DSB在不化学改变其核苷酸的情况下破坏DNA，因此被认为是DSB的最简单形式（左上方的方框）。 IR通过化学改变相反链中至少两个核苷酸来诱导DSB，这主要是由电离簇中的电离事件引起的（左下框）。以这种方式在末端生成的化学实体会发生变化，需要在DSB处理过程中将其删除。因此，此DSB比RE生成的DSB更“复杂”。由于电离簇可能包含两个以上的事件，因此生成的DSB可能在DSB附近伴随着其他形式的DNA损伤，形式是另外的单链断裂或碱基损伤。从某种意义上说，这将产生更高“复杂性”的DSB，因为它们将需要更广泛的处理（右下角的框）。有时，尤其是当细胞暴露于高LET颗粒时，会在一定距离附近生成多个DSB（右上方的方框）。以这种方式生成的染色质片段可能会丢失，因此可能会使染色质不稳定并损害DSB处理。因此，我们在这里将它们定义为DSB复杂性的附加级别。本文详细讨论了在单元格中定义DSB群集生成的后果。
        值得注意的是，对于两种形式的DSB复杂性，它们与高LET效应相关的支持性证据主要来自数学建模。 由于DSB部位存在非DSB病变，导致DSB复杂，存在生化实验证据，但是间接的。 结果，这两种形式的复杂性在提高高LET辐射效率方面的相对贡献仍然未知。
        下面，我们将描述我们最近开发的一种生物模型系统，该系统使用I-SceI归巢大范围核酸酶在细胞中生成简单的DSB和DSB簇[57]。 该系统基于基因组整合，因为具有I-SceI识别序列不同构型的构建体的多个副本，因此在酶表达后，会生成具有不同复杂度的单个DSB或DSB簇，并且在不同的情况下对其进行处理 端点。 由于此模型系统的验证需要有关高LET IR生成的DSB的处理信息，因此我们接下来将回顾可用的相关信息。

4.高LET IR诱导的DSB子集损害了c-NHEJ

        尽管增加了复杂性，但与低LET IR（例如X射线）诱导的DSB相比，高LET IR（例如56Fe +离子）诱导的DSB的活性有所降低，尽管效率有所降低（图4b）。 在其他细胞系和其他形式的高LET IR中也报道了类似的结果。 高LET辐射暴露后的DSB处理明显取决于c-NHEJ，因为在该途径中有缺陷的突变体显示出重新结合效率明显降低（图4b）。 在这些高剂量下残留的DSB处理反映了alt-EJ的功能，也可能反映了SSA的功能。 因此可以得出结论，很大一部分由LET-IR诱导的DSB被c-NHEJ处理[58]。
        LET IR高的一个惊人观察结果是，在c-NHEJ突变体中分析细胞存活率时，依赖LET的细胞杀伤增强作用消失了[58]。 这在图3a中进行了说明，该图显示了DNA-PKcs缺陷的M059J细胞对56Fe +离子和X射线同样敏感。 其他人在各种c-NHEJ突变体中也报道了类似的观察结果[59-64]。 值得注意的是，与低LET IR相比，GC突变体对高的敏感性明显更高[62]，这表明c-NHEJ发生了一些特殊的现象（图3b）。
        对此有趣观察的可能解释是，与高LET IR相比，野生型细胞通过使用c-NHEJ修复DSB的子集来修复其对低LET IR的放射抗性。 对c-NHEJ的加工变得难处理。 结果，由于高和低LET IR具有相似的DSB产量（图4），因此c-NHEJ缺陷型细胞对高和低LET IR同样敏感。 在我们看来，这种值得注意的观察表明，由特定辐射方式诱发的DSB形式有时会损害DSB加工途径，而c-NHEJ特别容易受到辐射LET的增加而产生的DSB形式变化的影响。 用过的。 但是，为什么c-NHEJ比其他DSB修复途径更容易受到高LET IR生成的DSB形式的影响，而DSB形式的哪种变化实际上抑制了c-NHEJ？
        我们假设c-NHEJ的大分子装置（由DNA-PK大小的蛋白质组成，并由几个其他相互作用的成分协调）必须像“瑞士手表”一样精确运行，以实验中无法比拟的速度除去DSB。 。 这种整体操作的准确性和速度可能对DSB群集的生成特别敏感。 我们推测，尤其是单个DSB靠近在一起的DSB群集可能会破坏其功能。 在暴露于IR的细胞中，DSB的簇只会引起一小部分DSB（更准确地说是染色质破裂事件）。 但是，随着辐射LET的增加，它们的产量将增加，并且群集中各个DSB之间的距离将减小。
        通过将细胞暴露在红外光下，不可能将DSB簇形成的假说作为导致高LET辐射作用以及相关c-NHEJ抑制的关键原因进行检验。 这是因为IR诱导了在整个染色质中分布在每个细胞不同位置的DNA损伤的艰巨光谱，因此无法对其后果进行分子分析。 为了解决这个问题，我们从事分子定义的DSB簇生物学模型的开发，以检查它们对c-NHEJ的抑制作用，并通过GC，alt-EJ以及可能的SSA分析其加工过程。 下面，我们简要描述此模型并总结结果，确认复杂的DSB簇抑制c-NHEJ的功能，同时允许通过其余修复途径进行处理。
        在本节中值得一提的一个相关观察是暴露于质子的细胞中DSB的产生，质子是低LET辐射形式，最好通过GC处理。 具体而言，观察到缺少同源重组DSB修复途径的蛋白质的细胞对质子比对光子照射更敏感。 染色质的背景和DSB诱导产生这种依赖于GC的细节仍有待阐明。 但是，该观察结果与质子在癌症治疗中的应用有关，因为质子可能特别适用于具有BRCA突变肿瘤分子特征的癌症，即“ BRCAness” [65,66]。

5. DSB群集抑制c-NHEJ并引起易位

        I-SceI归巢核酸内切酶是经常用于诱导人类基因组中DSB并研究其加工要求的RE。 I-SceI识别脊椎动物基因组中不存在的18个碱基对序列（I-SceI是酿酒酵母线粒体中内含子编码的核酸内切酶），但通常可以作为一个拷贝引入 根据所解决的问题设计的构造形式[67-70]。 整合位点可以是随机的，也可以使用针对该特定位置的构建体进行预先选择。 产生的克隆细胞系在可以精确知道的基因组位置携带该构建体，并通过用表达I-SceI核酸内切酶的载体转染细胞来诱导DSB（图6）[35,71]。
       尽管I-SceI像所有RE一样，诱发了可能的最简单形式的DSB（请参见上文），但它已成功用于阐明DSB处理途径的关键要求。 因此，我们选择了该系统，并设计了可通过可用的DSB修复途径研究DSB簇加工的构建体，首先着重于阐明上述高LET辐射的独特特征。
        为此目的，并且偏离了可用的I-SceI细胞系统，我们生成了包含多个I-SceI整合位点（而不是典型的单个整合）的CHO细胞系，以模拟通常在辐照细胞中诱导的多个DSB。 此外，我们设计了包含I-SceI站点的构建体，可以将其构建为单个副本以生成单个DSB，或者构建为成对和四联体生成DSB群集。 DSB之间的距离在大约50至200（平均核小体距离）碱基对之间变化。 图6总结了该研究中使用的细胞系，通过I-SceI限制性酶切产生的DSB簇的类型，以及用于I-SceI识别序列以生成可连接的（D）或不可连接的（R）顶端的方向 。 在此模型系统中的单元格中仅生成DSB。 完全不存在暴露于IR的细胞中的SSB和碱基破坏，其数量远远超过DSB。
        该模型系统是基于以下假设设计的：I-SceI的瞬时表达将通过生成单个DSB或DSB簇来破坏染色质。 每个此类事件均被视为与所涉及的DSB数量成比例的单个染色质“复杂性”破裂。 确实，单个DSB和DSB团簇在质量和数量上起始的初始γ-H2AX焦点形成的数量相当于整合位点，尽管在携带染色质的DSB团簇的区域中53BP1的积聚似乎增强了。 通过近端或顶端DNA末端的连接可发生染色质恢复[57]。
       DSB簇的第一个测试是高LET IR功效增强的推定原因，总结于图6c中，该图显示了I-SceI表达后不同克隆中的菌落形成。 显然，随着LET的增加，观察到的杀灭随着簇复杂性的增加而增加。 确实，带有I-SceI-四联体的绝大多数细胞都屈服于这种形式的DNA损伤。 因此，与单个DSB相比，DSB集群更可能赋予致死性，随着每个集群中DSB数量的增加，或者当末端不合时，细胞的致死性也随之增加。
        c-NHEJ中的缺陷与易位形成的增加有关。分析单个DSB和DSB簇的过程中形成的易位，如图6d所示，证明了诱导DSB簇后的发生率最高。值得注意的是，用DNA-PKcs抑制剂抑制c-NHEJ会在生成单个DSB和DSB对后增加易位的形成，但在生成DSB四倍体后却没有作用。由于细胞存活和易位形成相关，因此该结果概括了在c-NHEJ缺陷细胞中，随着LET的增加，杀伤力增强的缺乏。因此，我们认为这一观察结果证实了我们的假设，即DSB簇损害了c-NHEJ。在与PARP-1抑制剂（PJ34）孵育的细胞中，DSB四联体易位形成频率的大幅降低表明alt-EJ在这些条件下具有功能。目前正在研究SSA的可能作用，以及GC的原理内活化。

图6.png

图6.使用I-SceI识别序列的工程化簇研究中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中定义的DSB簇的生物学后果的模型系统。 （a）包含单个DSB，DSB对和DSB四联体并在CHO细胞基因组中多次整合的I-SceI构建体的示意图。 （b）生成的细胞系的说明，以解释所用的术语。表中列出了I-SceI位点的数量（1×，2×，4×），它们的方向（正D，反向R）以及积分数量。 （c）带有不同复杂性的DSB簇的CHO细胞的克隆存活实验。 （d）在中期未经任何处理或使用PARP-1抑制剂PJ34处理后在同一细胞系中形成的易位。 （e）通过与DNA-PKcs抑制剂NU7441孵育抑制c-NHEJ后，染色体易位的相对增加。显示的结果已发布并在此处重新绘制，以说明本评价中开发的概念[57]。

6. 结论

       我们提出了在脊椎动物细胞中进化的四个机制，用于处理DSB的机械途径不同的途径的理由，令人惊讶的是，它们具有重构原始基因组的非常不同的能力。我们认为，在细胞中，这些途径必须以允许首先参与最高保真度途径的方式进行连接-遵循旨在最大化基因组完整性的内在逻辑。我们进一步认为，当细胞使用较低保真度的路径处理特定的DSB时，它们这样做是为了解决因染色质而在处理过程中抑制高保真度路径而产生的必要性。由于DSB在染色质中的位置，以及在受影响的染色质域中的染色质活性（可能会干扰修复途径的功能）的结果，产生了这种必要性。由于DSB复杂性的增加，也出现了类似的必要性。使用定义的生物学模型系统获得的结果表明，DSB簇损害了c-NHEJ。通过比较缺乏c-NHEJ的细胞对高LET IR的反应，我们提出了一个假设，即高LET IR产生的增加的杀伤力的很大一部分来自DSB簇的产生。结果支持根据哪些小区没有自由选择一条处理DSB的途径，而是应用逻辑，以适应因实际情况而产生的必需品，而现实是从正在处理的DSB的特性中得出的。
        在脊椎动物细胞可用于去除DSB的四种加工途径中，只有GC忠实地将基因组恢复到其原始状态。 所有剩余的途径，特别是c-NHEJ，都作为DNA末端清除机制起作用，最终旨在使基因组中没有DNA末端开放。 c-NHEJ在高等真核生物中的极高效率引出了有关其进化益处的问题。 遗传相关物种之间的核型差异和癌症中新发现的色鳞病现象之间的巨大差异，支持了c-NHEJ可能充当进化加速器的假说。

作者贡献：G.I.，E.M.和V.M.的概念化； G.I. 和E.M .； 写作—原始草案准备，G.I.，E.M。和V.M .； 写作-审查和编辑 和E.M .； 可视化 监督 G.I.
资金：这项研究由“联邦教育和研究部”（BMBF：02NUK037B，CHROME和02NUK043B，COLLAR），DFG（IL-51 / 10，IL-51 / 11和GRK1739）提供资助。 ”（BMWi：ESA-AO-IBER-2017，50WB1836）。
利益冲突：作者声明没有利益冲突。