多肽合成和抗原制备

                                                         多肽合成和抗原制备

             半抗原（hapten）是只具有免疫反应性，而无免疫原性的物质，故又称不完全抗原。小分子属于半抗原，需要与大分子物质（载体）连接后，形成免疫原性，可以诱导产生免疫应答，产生抗体。化学合成的多肽，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而也需要与载体蛋白交联[1]。

一、多肽抗原的选择

        选择的多肽序列一般在15-20个碱基，单个抗原决定簇一般包含5-8个碱基，那么15-20个碱基的多肽一般会包含1个或更多个抗原决定簇。相对长一些的多肽段能够更好的保持和天然蛋白的一致性，更容易产生抗体。由于多肽是采用化学方法合成出来的，我们也要考虑到多肽合成的难度及其良好的可溶性。

        尽量少选择包含疏水性碱基（如色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等）的多肽。谷氨酰胺由于容易和肽链形成氢键而导致多肽不可溶，所以具有多个谷氨酸的多肽也要避免。

        半胱氨酸有利于将多肽偶联到载体蛋白上。所以应该保留多肽N端或C端的半胱氨酸，以便于载体蛋白偶联，从而具有较好的免疫原性。同时两个或更多半胱氨酸的情况需要避免，因为它会造成多肽链之间形成二硫键，进而导致不溶和结构变化。当选择的多肽缺少半胱氨酸时，我们可以在N端或C端加上半胱氨酸。

二．载体蛋白

       载体蛋白具有很多抗原决定簇，常用的是血蓝蛋白（keyhole limpet hemacyanin，KLH），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），卵清蛋白（ovalbumin，OVA）。

KLH	BSA	OVA
血蓝蛋白，是在某些软体动物、节肢动物（蜘蛛和甲壳虫）的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，与含铁的血红蛋白类似，它易于氧结合，也易与氧解离，是已知的唯一可与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈白色。其分子量450000～130000。由于KLH比BSA有更高的免疫原性，因而是最常被选用的载体蛋白	牛血清白蛋白（BSA）是一种来源于牛的血浆蛋白，分子量为7×104Da（含有59个Lys），属于最稳定的和可溶的白蛋白。大约有30-35个主要氨基可用于与链接剂发生共轭反应，使得BSA成为一种很流行的弱抗原化合物载体蛋白。因为BSA比KLH小，所以它比KLH更易溶于水。	卵清蛋白（OVA）是蛋清中含量最丰富的蛋白质，其分子量为4.5×104Da。它经常被用作第二载体蛋白，以确认抗体是特异性的肽，而不是载体蛋白，如牛血清白蛋白。

三．偶联方法[3]

       巯基修饰（通过Cys的侧链）用于与KLH、BSA或OVA发生共轭反应，所有携带巯基反应的功能基团经修饰都可被用来发生共轭反应[2]。最常见的是以下几种：

1.分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联

混合酸酐法	碳二亚胺法
混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法。半抗原上的羧基在正丁胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，形成混合酸酐的中间体，在与蛋白质的氨基反应，形成半抗原与蛋白质的结合物。	碳二亚胺（EDC）使羧基和氨基间脱水形成酰胺键，半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物，然后再与蛋白质上的氨基反应，形成半抗原与蛋白质的结合物。EDC被称作为零长度交联剂之一，因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子。此方法连接十分简便，只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中，然后加入水溶性碳化二亚胺，搅拌1-2h，置室温24h，再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基，可通过某些化学反应引入羧基。在引入羧基后，也可用上述方法进行偶联。

2.含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联

戊二醛法	重氮化法
双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键（-N=C＜），在半抗原和蛋白质间引入一个五碳桥。这一反应条件温和，可在4-40℃及pH6.0-8.0内进行，操作亦简便，因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联作用，因此最好使用新鲜的戊二醛。	用于活性基团是芳香胺基的半抗原，芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐，它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上，形成一个偶氮化合物。

3.含羟基半抗原的偶联

琥珀酸酐法	羰基二咪唑法
半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半酯（带有羧基的中间体），再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合，在半抗原与蛋白质载体间插入一个琥珀酰基。	N，N-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂，在肽合成中首次表明了是形成极好的酰胺键试剂。含羧基的分子同羰基二咪唑反应，形成中间体咪唑基甲酸酯，它能和N-亲核试剂反应，得到N-烷基化的甲酸酯键，通常蛋白质通过N-端（α-氨基）和赖氨酸侧链的（e-氨基）和分子形成不带电的类似尿烷的衍生物，具有极好的化学稳定性。

        卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)提供的是标准的线性肽，并可根据客户的项目需求，提供各种修饰肽合成服务。修饰肽广泛应用于多肽药物研究、免疫学、诊断学、生物催化剂、抗体修饰和多肽试剂等领域。卡梅德生物提供多种多肽修饰的服务，我们可以对多肽序列进行酰胺化或乙酰化，对二硫键进行修饰，也可标记多肽；我们主要使用BSA、KLH以及OVA进行多肽偶联服务。卡梅德生物提供的多肽修饰与偶联服务是基于我们技术专家的丰富经验以及先进技术，我们可以满足客户的多种需求。

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1. 孙俊,孟哲峰,徐建青,等.HIV-1辅助蛋白Vpr多肽抗体的制备与鉴定[J].病毒学报, 2012(002):028.
2. 孙锋,张学农.多肽的固相合成及载体蛋白修饰[J].化工管理, 2016(11):2.DOI:CNKI:SUN:FGGL.0.2016-11-038.
3. 杨霜,李舒伟.固相标记物及其制备方法,固相载体多通道多肽或糖肽及其制备方法:CN202110172309.9[P].CN112961071A[2023-10-18].