Cell—Engineering Quantitative Trait Variation for Crop Improvement by Genome Editing

结果（上）：

使用CRISPR/Cas9突变顺式作用元件（CRE）重新创建果实形状的QTL

番茄驯化的主要特征是在果实大小方向上的显著增加。而果实的大小在很大程度是由花中心皮数量的增加和后面种子隔室的增加。影响番茄心室数目的QTL包括参与经典的CLAVATA-WUS茎细胞回环的基因。CLV-WUS调控着分生组织的大小。在CLV-WUS途径中的突变，如在信号肽基因SLV3的突变，能够导致分生组织增大由于茎细胞的过度分裂。过度分裂会导致花和水果中增加额外的器官而引起发育缺陷。番茄的野生种pim，能产生小的两心室果实，对驯化后的番茄，fas和lcQTL对增加LC的数目和果实大小有作用。fas是由一个到位导致的部分功能的缺失。这个到位是番茄中CLV3启动子的打乱，导致了在心室数目的增加效应。相比之下，lc是一个弱的功能获得性等位基因。之前该等位基因被认为是SlWUS下游的预测的一个15bp的一个抑制元件的2个SNP有关系。而WUS基因是一个促进茎细胞分裂的保守的同源异形基因。而没有功能验证，这个顺式作用元件有着拟南芥CArG元件的相同之处，而这个元件被限制MADS box转录因子AGAMOUS在花发育后期限制去下调WUS和终止分生组织的活性。

为了确定是否在知道的CERs上诱导突变能够产生可预测的定量突变，我们使用CRISPR/Cas9去靶定预测的SlWUS的CArG元件。这对lc的影视是微弱的，在pim的渐渗系中有着11%的果实产生了3到4个心室产生。与此一致的是，lc并没有导致SlWUS的表达量的明显变化，这个结果表明，lc微弱影响表达的水平、时间和模式。显著的是，来自带有一个CRISPR/Cas9诱导的在CArG元件中缺失4-bp的pim植株中10%的果实存在3个心室，这和lc的弱影响保持一致。我们之间表明联合fas和lc来增加心室数目是由于在CLV-WUS循环中的异显性上位。我们构建了pim-lc CRfasNIL植株，发现这个心室数目超过fas单独突变（76%：43%果实有3个或更多的心室）和pim lcNILfasNIL植株，这表明CArG的缺失等位基因模仿了lc的功能。重要的是，我们在栽培番茄品种M82证明了这个影响。M82中，60%的果实有2个心室，40%有3个心室。我们发现了带有在抑制基序中存在5-bp缺失的lcCR的70%番茄果实存在3个或更多的心室。这个影响在双突变体中得到加强。这些结果证明，lc是由于SlWUS CArG元件的突变导致的，并证明了QTL能够通过突变已知功能的CRE来设计。

CLV3启动子的CRISPR/Cas9突变产生了新的顺式调控元件等位基因

重现lc的影响表明，靶向以前已知的顺式调控区域的CRISPR/Cas9能够创造已存QTL的新的等位基因。但是，那些来定位于调控区域的QTL来解释的精确诱导的突变还是很少知道的，尤其是那些存在多SNP或者结构变异（SVs）的QTL区域的例子。而且在顺式调控元件中，模块化的管理和内在的冗余使定义有用的目标变得极端挑战，尤其是产生对特定数量性状产生特定修饰。然而，我们假设这些特性能够被利用去创造一系列顺式调控等位基因，这些等位基因带着包含许多gRNAs的基因的启动子区域带来的一系列定量转录和表型的改变。尽管在每一个目标位点同步或不同步Cas9-gRNA引导的切割和不精确的修复，一组突变的类型能够被诱导，包括在目标位点的不同大小的缺失和小的插入。这些产生的等位基因形成的突变能够影响许多的CRE，顺式调控模块或者她们的空间，能够通过后代产生的稳定同义突变而出现的表型为被评价。

我们通过设计一个CRISPR/Cas9的包含8个靶向M82 SlCLV3编码区紧接上游的2-Kb的启动子区域的而没有考虑任何预测的CERs的gRNAs载体来检验这个概念。6个第一代转基因植株（T0）按照以前的方法被产生。显著的是，这些植株的花产生处理更多的器官和WT相比，T0-2拥有的器官数目在fas和CRISPR/Cas9产生的clv3编码区的敲除突变。PCR和测序认为T0-2是带有前4个靶点出有一个小缺失和从第5个开始超过第8个靶点的一个1Kb的缺失的等位基因的纯合子。比较起来，T0-1表型出的是所有目标靶点存在1.6Kb的大缺失的纯合子，但是器官数目上只一点点的改变。4个剩下的T0植株中的2个表型出弱的影响，并至少是3个等位基因的嵌合体，其中在T0-4中的一个等位基因和T0-1有相同的缺失。

在第一代转基因中获得来自CRISPR/Cas9的纯合突变体是很稀少的，考虑到那个1.6Kb的缺失超过了T0-2的绝大部分的缺失的弱突变的T0-1的表型是令人奇怪的。为了检测这些等位基因的遗传性和证实他们的表型影响，我们对通过自己产生的T1后代进行基因分型。出人意料的，T0-1和T0-2的后代遗传了一个不能够通过PCR扩增等位基因。在每一个T1后代中，为了掩盖的基因接近四分之一的纯合子分离比表明，T0植株是双等位基因，带着第二个等位基因潜在的有一个大的阻止PCR扩增的结构变化。为了更好的鉴定这些等位基因，我们对纯合的T2后代的基因组进行测序，基因组表明在T0-1的另一个等位基因存在一个复杂的重排，和一个在T0-2中跨过CLV3编码序列的7.3Kb的缺失。我们后来用这些数据表明没有可以检测到的脱靶突变，这支持CRISPR/Cas9的高度专一性。定量基因型表明，SlCLV3CR-pro2-2纯合子在花器官上的增加与clv3CR突变体一直，证明了SlCLV3CR-pro2-2是一个空的等位基因。相比较而言，来源于T0-1和T0-2纯合子表现出比clv3cr更轻微的影响，表明了亚等位基因的基因型。最后，我们发现，SlCLV3CR-pro1-2纯合体很想WT，解释了原始双等位基因T0-1植株的微弱表型。这些结果说明带着各种靶向一个启动子的不同区域的gRNAs的CRISPR/Cas9转基因植株能够有效的创造新的顺式调控突变体和产生表型变化的等位基因，可能包括靶区域内外的意外损伤。

一个顺式工作的CRISPR/Cas9-驱动的突变体筛选允许slCLV3启动子等位基因定量突变的快速产生和评价

Atrans-Acting CRISPR/Cas9-DrivenMutagenesis

来自于T0植物中的SlCLV3启动子的等位基因表明靶向调控序列的CRISPR/Cas9能够产生新的基因型和表型突变。然而，每一个T0植物只提供少许带着或强或若的影响。在早期，我们期待数十个或更多的等位基因将被需要同获得一系列等位基因能够包含全方法位的定量突变。然而，标准的转基因方法将是费时间和钱的。为了解决这些限制，我们设计了一个简单的开发反式后的CRISPR/Cas9转基因的通过与野生杂交的诱导出更多突变的遗传遗传流程。使用这种方法，来自于一个T0的杂合子个体遗传了单拷贝的转基因的所有F1植株将有产生一个或更多的新的等位基因的潜能通过靶向野生启动子通过杂交产生的。然而，确定那个特异的F1个体拥有新的引起表型变化的等位基因是非常困难的。一个可以讲述的例子是CLV3CR-pro1-2等位基因的复杂重排，这个等位基因对花器官数目没有影响，因此补充和掩盖了来源于双等位基因的T0-1植株中强的失去功能的大的缺失的等位基因的影响。同时的为了最大化等位基因的创造和有效识别这些表型，我们对拥有强的丢失功能的等位基因的T0进行杂交去产生一个激活的杂合的F1植株群体。使用这种方法，带有一个CRISPR/Cas9的转基因，已经遗传了一个稳定的缺失功能的等位基因的成百的F1后代，能够容易获得和用于筛选新新的失去功能的等位基因，包括那些导致细微的很难被检测的表型。

为了检测这种方法，我们杂交T0-2和WT产生了1152个由SlCLV3CR-pro2-1 or SlCLV3CR-pro2-2 和一个a WT SlCLV3 promoter组成的杂合的F1植株。PCR基因型表面几乎一半的群体（42%）遗传了CRISPR/Cas9的转基因，对这些植株的479植株表型分型表面116个单株比对照有更多的话器官。而80%的植株显示弱的影响，24显示出和fas相似或更强的表型。这些发现表明了结合了减少遗传的Cas9-gRNA的活性和一个敏感的背景去高效产生大量的顺式调控带着明显表型影响的力量。