ChIP-seq文章 | 刺参MITF转录因子调控体色形成和分化的分子机制

今天给大家带了一篇刺参的ChIP-seq项目文章解读，刺参是一种具有生态意义的棘皮动物，具有重要的营养和治疗价值。刺身的颜色变化是其最重要的栽培性状之一，因为颜色影响其生物活性成分、味觉和市场价格。该研究就是利用ChIP-seq技术探讨了刺参体色形成和分化的分子机制。

MITF通过表达差异和下游基因调控促进刺参体色分化

发表期刊：Biology

影响因子：5.168

发表时间：2022年12月20日

发表单位：中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验

2022年12月20日，中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验孙丽娜研究员团队在期刊Biology发表题为“Cucumbers Apostichopus japonicus through Expression Differences and Regulation of Downstream Genes”的研究论文。微量邻苯二甲酸相关转录因子（Microphthalmia-associated transcription factor，MITF）是黑素细胞发育和黑霉素合成途径中最关键的基因之一。该研究选取3种颜色刺参作为研究对象，利用ChIP-seq技术挖掘MITF的调控基因，以此探索刺参体色形成和分化的分子机制。

研究材料

绿色刺参、白色刺参和紫色刺参

技术路线

 研究结果

1.  三色形态刺参中MITF的差异表达

该研究利用qPCR和Western blot检测MITF在三色形态刺参中mRNA和蛋白的表达水平。mRNA与蛋白表达的相关性检验显示两者存在显著相关（P<0.01）。紫色刺参的mRNA和蛋白相对表达水平都是最高的，白色刺参是最低的。

基于这点发现，作者认为MITF的表达与刺参黑素细胞的分化密切相关，以及三种颜色刺参黑素细胞密度的差异是由于MITF表达的差异造成的。研究结果表明，MITF在基因剂量依赖模式的黑色素合成和色素沉着中发挥了关键作用，并可能参与了体色分化。

图1白色、绿色和紫色刺参体壁mRNA和蛋白的相对表达水平 

2. MITF在mRNA水平上的空间表达

采用原位杂交法观察MITF mRNA的空间表达情况。研究发现MITF在白、绿、紫刺参中的表达位置没有差异，主要表达于表皮。

图2 刺参白、绿、紫体壁MITF的荧光原位杂交分析 

3. MITF ChIP-seq分析

识别转录因子（TFs）的基因组结合位点对于确定参与生物过程的转录调控网络非常重要。ChIP-seq可以有效地在全基因组范围上筛选出与TFs互相作用的结合位点。该研究利用ChIP-seq筛选转录因子MITF的靶基因，并对这些基因进行了表征。

该研究鉴定的峰分别与绿色、紫色和白色刺参中的727、557和887个基因相关。超过60%的MITF结合序列位于其靶基因的转录起始位点的远端。MITF ChIP在绿色刺参中显著富集的KEGG通路包括酪氨酸代谢、曲烷、哌啶和吡啶类生物碱的生物合成、核糖体、内质网蛋白质的加工、蛋白激酶和原核生物的防御系统。在紫色刺参中，显著富集的KEGG途径为曲烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成、硫胺素代谢、硫代谢、RNA聚合酶和苯丙氨酸、 酪氨酸和色氨酸的生物合成。在白刺参中，它们是Wnt信号通路、鞘脂信号通路、核黄素代谢、视网膜代谢和蛋白激酶。

图3 绿色、紫色、白色刺参MITF结合序列的峰分析 

4. 比较分析不同色态刺参鉴定的基因

为了鉴定不同刺参颜色变种中MITF调控基因的差异，作者将MITF ChIP在紫色和白色刺参中鉴定的基因与在绿色刺参中鉴定的基因进行比较分析。然后，还对这些基因进行了GO和KEGG富集分析。与绿色刺参相比，紫色刺参显著富集的GO项有：巨核细胞分化的负调控、端粒组织、含有核小体组装的CENP-A、复制依赖性核小体组装以及靶向RNA的DNA聚合酶活性。相关的KEGG通路包括硫胺素代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、脂酸代谢、apelin信号通路和p53信号通路。与绿色刺参相比，白色刺参差异结合基因显著富集的GO项有基因表达的负调控、巨核细胞分化的负调控、rDNA染色质沉默、巨核细胞分化的调控和端粒组织等。相关的KEGG通路包括烟酸和烟酰胺代谢、MAPK信号通路、核黄素代谢、hippo信号通路、cAMP信号通路和ErbB信号通路。

5. Motif分析

该研究中利用HOMER软件进行motif分析，首先是重头预测（de novo）motif。与绿色刺参相比，紫色刺参中有18个MITF特异结合峰的de novo motif 富集。当每个峰对应的DNA序列与已有的TF结合位点motif进行比较用于获得所有可能的TF结合位点时，发现有11个motif富集。与绿色刺参比较，在白色刺参的MITF特异结合峰有20个de novo motif和22个已知motif富集。

紫色刺参中，IRFmotif是紫色刺参中MITF特异性结合峰鉴定最多的motif。其他已知的motif包括Nkx3.1、LXRE、RORgt、CRE、NFkB‐p65、RAR: RXR、PR、HOXD13、PAX5和FOXA1: AR。HRE、THRa和Stat3 motif是白刺参中MITF特异性结合峰的前三个鉴定到的motif，其他已知motif包括GEI-11、Foxh1、Elk4、FHY3、Tbx20、LXRE、Tcf3、Mef2b、Tcf4、RAR：RXR和NF1。

研究结论

研究评估了MITF在不同颜色形态中的表达水平和分布，并使用ChIP-seq方法分析了MITF在绿色、白色和紫色刺参中调控的基因。ChIP-seq鉴定的结合位点提高了我们对刺参中关键motif和调控关系的理解。研究结果也为基因功能和体色形成和分化的机制提供了见解。