CRISPR-Cas9基因编辑3--sgRNA-Cas9质粒构建

简介和前期文章

我对之前的所有教程进行了再次详细的总结
CRISPR-Cas9基因编辑之背景介绍及gRNA设计（上）
CRISPR-Cas9基因编辑之gRNA设计（下）

前言：

前文我们提到根据sgRNA、Cas9的产生和投递方式的不同，实验方案也不尽相同。目前我所了解的有以下几种，

欢迎大家补充：

1. 将sgRNA Oligo插入到pSpCas9质粒中，将质粒转入细胞之后，sgRNA和Cas9在细胞内合成；
2. 将含有sgRNA和Cas9的质粒共转染入细胞，sgRNA和Cas9在细胞内分别合成；
3. 将1和2这两种形式的设计包装成慢病毒，使用慢病毒将sgRNA和Cas9插入到基因组中，如后续还有慢病毒转导计划，则会有抗性冲突的可能，因此需要考虑清楚后再做决定；
4. 使用腺相关病毒AAV转导，在动物上使用较多，也有非常好的文章使用该系统达成敲入的目的；
5. 将具有活性的Cas9和sgRNA直接转入细胞中，适合转染难度大的细胞，但是后续的筛选需要另外设计。

注意：插入不代表一定是过表达，插入破坏启动子可造成敲低或者敲减，因此有一个专业名词为indel (insertion/deletion)

实验方案正文--cloning sgRNA into pSpCas9 plasmid ~ 3 Days

在这里我直接选择将sgRNA整合到pSpCas9质粒中，只转染一个质粒的方法，同时该质粒带有EGFP标记，可用于筛选。

1. 实验准备

细胞：293T工具细胞，目的细胞，DH5α、stal3感受态细胞（可自行制备）

试剂盒：质粒小提、基因组DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒

常规试剂：X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent-Roche （推荐），lipofectamine 3000 （life 公司）；Lipofectamine Stem Reagent (干细胞所需转染试剂），CloneR，ROCK inhibitor（干细胞相关需要）；当然也可以使用电转的方法，可选Bio-Rad和Lonza等公司产品。

质粒准备：常用Cas9质粒，例如pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene #75232

限制性内切酶：实验室常用限制性内切酶，BbsI核酸内切酶

仪器准备：流式分选，IncuCyte活细胞工作站

软件准备：Snapgene

比较贵的试剂主要集中在干细胞相关试剂：Lipofectamie Stem价格可达lipo3000的2.5~3倍；CloneR和电转试剂都比较贵；Incucyte可实时跟踪并定时对细胞拍照，是挑单克隆的利器，如果没有的话则挑单克隆工作量巨大。

2. 实验步骤--将sgRNA插入pSpCas9质粒中

（1）用ddH2O配置100 μM的sgRNA top/bottom oligo溶液，按照以下方法配比，图中已经标出我们调整的部分：将T4 ligation buffer和T4 PNK直接删除

image.png

（2）使用PCR仪按以下程序anneal oligos: 95 °C for 5 min; 按照每5℃/min的速率降低至25 °C ; 12 °C hold。

原文方法为 Phosphorylate and anneal the oligos in a thermocycler by using the following parameters: 37 °C for 30 min; 95 °C for 5 min; ramp down to 25 °C at 5 °C min−1; 12 °C hold. 主要删除了37 ℃孵育30 min的步骤。

（3）取1 μL步骤（2）得到的产物，用ddH2O稀释200倍。

（4）配制实验mixture

image.png

根据课题组情况调整如下：更换骨架质粒，选用更合适的启动子；将T7连接酶改为T4连接酶。

Components	Amount (μL)
PX458-EF1a-pSpCas9(BB)-2A-GFP, 100 ng/μL（质粒为课题组师兄所构建，更换启动子）	1.0
Diluted oligo duplex from Step（3）
T4 ligation buffer，10 x	2.0
BbsI 核酸内切酶（贵）	1.0
T4 ligase	0.5
ddH2O	to 20

（5）修改原文中的孵育程序并删除步骤（6）：

原文

image.png

修改过后

( 37 °C 25 °C )	37 °C	65 °C	12 °C
( 5 min 5 min ) 6 cycles	30 min	5 min	hold

3. 实验步骤--将上一步实验所得连接产物转化到感受态细胞中

参考常规感受态细胞转化实验步骤即可，并无特殊要求，最终可得到几十到上百个克隆，挑取数个单克隆扩增并使用去内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证sgRNA插入成功后即可，具体细节在下次文章中会有所提及。

image.png

本节完成，撒花~~