测序技术

     众所周知，DNA序列就是有TCGA四种碱基按照一定的排列顺序排列而成，但是如何才能将每一个位置上的碱基识别出来却是一个很难解决的问题，正是因为这要的需求，测序技术也在科学家们的不断努力下开始慢慢的发展了起来。今天我们就来介绍一下测序技术发展的前世今生。

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第一代测序技术：

    第一代测序技术通常是指桑格（Sanger）和考尔森(Coulson)开创的链终止法或者是马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链解法）。今天这里重点讲一下桑格测序法，因为其他测序方法的核心也是利用了桑格测序中中断DNA合成反应的原理。

    桑格测序法的核心原理是利用ddNTP（双脱氧核苷酸）代替dNTP（脱氧核苷酸），ddNTP由于3’位没有羟基，就会导致没有办法结合下一个核苷酸，从而使反应终止。这样就可以得到不同长短的序列片段，每个片段的末端都是一个ddNTP。

在此基础之上，给每一个双脱氧核苷酸加上荧光发光基团，并且每一种碱基的发光基团的颜色不同，然后通过颜色来识别不同的位置碱基序是哪一个。

这里需要说明一下的就是在合成DNA的过程中除了加入ddNTP和其他一些必要的酶之外，还需要加入能使DNA进行正常合成的dNTP，这样才能使DNA正常合成不同长短的DNA片段，然后再在这些片段的基础上随机结合ddNTP，最后通过测定ddNTP的荧光信号来测定某个位置是哪一个具体碱基。如果只加入ddNTP的话，反应则永远终止在第一步，则只能测定第一个位置是哪一个具体的碱基。

更加详细的内容很难用文字来表述，推荐两个视频给大家：

桑格测序法基本原理：https://www.bilibili.com/video/av44735204?from=search&seid=15245763323065606962

陈巍学老师的第一代测序技术的原理：https://www.bilibili.com/video/av3174601?from=search&seid=9488703116600135042

第二代测序技术：

    二代测序技术有很多，但是很多现在都已经不用了，这里我们就讲解一下二代测序的巨头——Illunima测序（占市场99%）。其原理是基于可逆终止的荧光标记dNTP来做边合成边测序工作，简单地说就是将打断的DNA片段利用桥式PCR扩增之后再利用荧光信号来进行辨别，这里需要注意的有几个点：第一，在flowcell中的每个簇对应一个片段，每个槽中都有很多个簇，之所以这样做是为了后面在桥式PCR之后荧光信号被增强，方便测量，也提高准确度。第二，由于碱基被进行了特殊的修饰，所以每次合成只能添加一个碱基，每进行一次合成就会放到测序的机器上进行一次荧光信号检测，记录荧光信号，推出碱基。第三，测序完成之后，一轮测序完成后，会对已经添加到序列上的碱基进行处理，也就是让它变回原来正常的样子，用以进行下一步的合成，然后重复合成测序修饰合成测序修饰。

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相比于第一代测序技术，第二代测序技术的有点就是高通量，一次可以测很多序列，而且准确性也不低，缺点就是测序的长度一般在200-500bp。

同样的给大家推荐两个视频，帮助大家理解：

Illunima测序原理：https://www.bilibili.com/video/av37902855/?spm_id_from=333.788.videocard.2

陈巍学老师的Illunima测序化学原理（不是原版，但是有字幕）：https://www.bilibili.com/video/av23072634/?spm_id_from=333.788.videocard.2

第三代测序技术：

    第三代测序技术是一种单分子测序技术，在测序过程中不需要进行PCR，实现了对一条DNA分子的单独测序，相比二代测序技术，由于只测定一个分子的，这样就减少了二代测序不同片段合成不同步的噪音，同时还可以测定出碱基的甲基化以及突变的情况，三代测序的原理主要有两种，一种是单分子荧光测序，一种是纳米孔测序，这里主要讲一下PacＢｉｏ测序技术原理：这种测序方法主要是在一个测序板上的测序小孔中固定一个聚合酶，然后当这个聚合酶每结合一个带荧光的碱基（荧光基团结合在焦磷酸基团上）时就会保持这种结合模式一段时间，小孔中有激发光不断打入，这个碱基就会发出荧光，仪器根据颜色判断是哪一种碱基，一段时间后，焦磷酸基团会掉落，因此荧光基团也会随焦磷酸基团掉落，不影响下一轮的测定，然后结合照射测定掉落结合照射测定掉落反复进行，直至全部测定完成。

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相比二代测序技术，三代测序技术所需的时间更短，测定的长度最长可到３万个碱基，同时还可以测出碱基基团的甲基化和突变情况，越来越受到人们关注。 同样的两个视频推荐给大家方便理解，我也是在看了很多视频之后才懂了这一丁半点。由于没有找到很好的ＰａｃＢｉｏ测序技术的视频，所以这里只能给大家放一个陈巍学老师的对于该技术的原理的讲解视频：https://www.bilibili.com/video/av79281575?from=search&seid=10411536782770729419

    每一代测序技术都有很多种，但是由于个人能力和时间关系，没有办法把每一种都展示出来，如果大家有对哪一种测序方法感兴趣，可以私信我，我本身就是生信专业，所以了解每一种测序方法是职责之内的事也是对自己的一种锻炼，我会尽量去了解透之后为大家展示出来，感谢指点。

    如果文章有什么不对的地方请大家多多批评，下期文章我想主要讲解拿到序列之后该怎么解读，怎么分析，请大家多多关注。