学习小组Day7笔记--刘洪

二代测序大体流程

sample preparation

• 超声波打断DNA成300-500bp（人类）加PE adapter（双端测序primer结合位点）
• index1和index2（为区分双端测序的是否为同一序列）
• p5 tail和p7 tail（与lane中的接头互补，为后面形成桥式连接的基础）

上样

• DNA片段在flowcell的lane中进行流动吸附
• 每个序列首次只能与lane中的P5'相结合

桥式PCR

• p5 ---> p7方向合成一条固定于lane p5上的互补链
• 去杂：加入NaOH强碱性溶液使双链DNA变性，互补链由于和lane上短序列强力连接固定住了；模板链失去了双链氢键连接，好似悬空，它会被洗脱
• 桥式形成：加入缓冲溶液，互补链的p7’和lane上的p7互补，目的是快速扩增lane p7接头连接的链，它和我们的模版链是一致的。我们后来测序只用这一半
• 桥式PCR：大约35个循环后，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，称为cluster，这是一群完全相同的序列。目的在于实现放大单一碱基的信号强度，满足后期测序需求
• 解链： 桥式PCR完成后，形成了很多的桥形的互补双链，再次强碱解链。这一次不再进行复制，而是利用一种酶--甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）选择性的切掉lane 上p5‘ 连接的链，只留下了与lane p7连接的链即Forward Strand。测序只用固定在p7上的一条链。

sequencing

• 边用带有荧光的碱基合成序列，边进行荧光扫描测序
• 一个荧光碱基结合上去之后，会加入化学试剂淬灭荧光信号并使dNTP 3’ 叠氮基团变成羟基，使其不发光。
• 接下来再加带有荧光碱基的缓冲液，进行下一轮
• Index测序： 上面的循环结束后，read product被冲掉，index1 primer和链上的index1 互补配对，进行index1的检测。测完后，洗脱产物，得到index1 的序列。接下来p5与lane上的p5‘配对，测得了index2，并洗脱

• 双端测序之Reverse Strand
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