科研狗Poppy
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生信星球学习小组第29期第七天

第一代

桑格尔-双脱氧链终止法

原理

固定的点开始
随机在某一个特定的碱基处终止
并且在每个碱基后面进行荧光标记
产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸
尿素变性的PAGE胶上电泳检测获得可见DNA碱基序列

优点

准确性高达99.999%

缺点

通量低
1000bp

第二代

循环阵列合成测序法/高通量测序技术

原理

先将片段化的DNA两侧连上接头
用固着着芯片的引物进行Bridge PCR
得到上百万条相同的DNA簇
再加入4种不同荧光标记的终止型dNTP，每渗入一个此dNTP反应即终止
洗去未参加的dNTP后读取荧光数据，得到一个位点的序列
切去终止dNTP上的阻断基团后即可进入下一轮测序
如此循环50次左右
同时对上百万个DNA簇进行边和成边测序
最后用计算机进行分析
得到DNA簇的序列
最后拼成全基因组序列。

优点

增加数据产出
降低测序成本

代表

Illumina公司推出的HiSeq2000、1500/2500、3000/4000、HiSeq X-ten MiSeq、NextSeq500
Life公司推出的Ion-PGM (Personal Genome Machine)
Ion-Proton Qiagen公司推出的GeneReader NGS system
华大(BGI)收购Complete Genetics后推出的BGISeq-100，BGISeq-1000
Roche公司454 GS FLX plus及454 Junior
Life公司SOLiD 5500
Helicos公司Heliscope

第三代

代表

SMRT
纳米孔单分子测序技术

原理

以单分子为目标的边和成边测序

优点

不需要经过PCR扩增
实现对每一条DNA的单独测序
关键技术
荧光标记核苷酸
纳米微孔
激光共聚焦显微镜实时记录微孔荧光
远长于二代测序技术的序列读长
直接测RNA序列
测甲基化的DNA序列

缺点

单读长错误率偏高，需要重复测序纠错，以PacBio SMRT技术为例，错误率高达15%
随机出错，需要进行多次测序纠错，增加了测序成本
对DNA聚合酶活性依赖度也较高
运用率没有二代测序普遍，其生信分析软件丰富度不够，积累较少。


测序原理.png

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