写在前面：本文为微信公众号:生信星球的数据挖掘线上班的随堂笔记，感谢小洁老师的付出！
GEO
0. 背景
- 火山图就是ggplot2点图
- KEGG富集分析
- BgRatio（background）：该通路总基因/收录KEGG的总基因
- GeneRatio：输入的差异基因数中属于该通路的/输入的所有差异基因
- 人与动物geneid转换：bioconductor
1. 数据下载
getGEO函数的功能：下载文件（.txt.gz）并生成变量
-
检查一下下载大小是否等于源文件大小。
如已下载的文件不完整则删除本地文件后再下载。
#数据下载
rm(list = ls()) #清空环境变量
options(stringsAsFactors = F)
library(GEOquery)
gse = "GSE42872"
eSet <- getGEO(gse,
destdir = '.',
getGPL = F) #
- 下载后：
class(eSet[[1]])
- 运行结果【1】ExpressionSet是一种数据结构，【2】 biobase是一个包
- ExpressionSet中包含表达矩阵和临川信息
- 表达矩阵提取：
exprs([[1]])) - 检查是否有log，如果数值过大未经log，则运行exp = log2（exp+1）
- 临床信息提取：pData(eSet[[1]])
- 判断临床信息的行名与表达矩阵的列名是否一致。
#(1)提取表达矩阵exp
exp <- exprs(eSet[[1]])
exp[1:4,1:4]
#exp = log2(exp+1)
#(2)提取临床信息
pd <- pData(eSet[[1]])
#(3)调整pd的行名顺序与exp列名完全一致
p = identical(rownames(pd),colnames(exp));p
if(!p) exp = exp[,match(rownames(pd),colnames(exp))] #妙啊，将exp的列名与pd 的行名对齐后取列
#(4)提取芯片平台编号
gpl <- eSet[[1]]@annotation
save(gse,pd,exp,gpl,file = "step1output.Rdata")
- 将变量们存储为Rdata
2. 数据处理！非常重要！
- 从pd中获取分组信息，
str_detect(向量，“字符”)#检测某个向量是否含有某个字符。
套上ifelse里的函数
x <- ifelse(str_detect(pd$title ,"Control"),"ctrl","treatment") #生成分组向量
- 可以去geo官网上找到分组信息对照一下。
- 把group_list变成因子：level中前面一个是参考水平(即ctrl在前面)。
group_list = factor(group_list, levels =c("control","treatment"))
3. 探针id转换
- 使用Bioconductor包找到对应函数。
- 使用Totable函数找到包对应的id转换矩阵
- 使用ctrl+F把“hugene10sttranscriptcluster”换成新芯片GPL对应的名称
#1.group_list(实验分组)和ids(芯片注释)，每次都需要改
rm(list = ls())
load(file = "step1output.Rdata")
library(stringr)
#group_list----
#第一类，现成的某一列或在某列中包含。
pd$title
#第二类，自己生成
group_list=c(rep("control",times=3),rep("treat",times=3))
group_list
#第三类，ifelse
library(stringr)
group_list=ifelse(str_detect(pd$title,"Control"),"control","treat")
#设置参考水平，对照在前，处理在后
group_list = factor(group_list,
levels = c("control","treat"))
#2.ids-----------------
#方法1 BioconductorR包
gpl
#http://www.bio-info-trainee.com/1399.html
if(!require(hugene10sttranscriptcluster.db))BiocManager::install("hugene10sttranscriptcluster.db")
library(hugene10sttranscriptcluster.db)
ls("package:hugene10sttranscriptcluster.db")
ids <- toTable(hugene10sttranscriptclusterSYMBOL)
head(ids)
# 方法2 读取gpl页面的soft文件，按列取子集
# 方法3 官网下载
# 方法4 自主注释
save(exp,group_list,ids,file = "step2output.Rdata")
列数太多不要view变量，会卡，行数太多没事
如果绘图函数没出图:dev.off()然后dev.new()
rm(list = ls())
load(file = "step1output.Rdata")
load(file = "step2output.Rdata")
#输入数据：exp和group_list
#Principal Component Analysis主成分分析
#http://www.sthda.com/english/articles/31-principal-component-methods-in-r-practical-guide/112-pca-principal-component-analysis-essentials
dat=as.data.frame(t(exp))#转置数据为主成分分析所需的
library(FactoMineR)#画主成分分析图需要加载这两个包
library(factoextra)
# pca的统一操作走起
dat.pca <- PCA(dat, graph = FALSE)
pca_plot <- fviz_pca_ind(dat.pca,
geom.ind = "point", # show points only (nbut not "text")
col.ind = group_list, # color by groups
#palette = c("#00AFBB", "#E7B800"),
addEllipses = TRUE, # Concentration ellipses
legend.title = "Groups"
)
pca_plot
ggsave(plot = pca_plot,filename = paste0(gse,"PCA.png"))
save(pca_plot,file = "pca_plot.Rdata")
#热图
cg=names(tail(sort(apply(exp,1,sd)),1000))
n=exp[cg,]
#绘制热图
annotation_col=data.frame(group=group_list)
rownames(annotation_col)=colnames(n)
library(pheatmap)
pheatmap(n,
show_colnames =F,
show_rownames = F,
annotation_col=annotation_col,
scale = "row")
dev.off()
新手不要改变量名噢
4. 差异分析
- 拿到数据先看class和dim
rm(list = ls())
load(file = "step2output.Rdata")
#差异分析，用limma包来做
#需要表达矩阵和group_list，不需要改
library(limma)
design=model.matrix(~group_list)
fit=lmFit(exp,design)
fit=eBayes(fit)
deg=topTable(fit,coef=2,number = Inf)
#为deg数据框添加几列
#1.加probe_id列，把行名变成一列
library(dplyr)
deg <- mutate(deg,probe_id=rownames(deg))
head(deg)
#2.加symbol列，火山图要用
deg <- inner_join(deg,ids,by="probe_id")
head(deg)
#按照symbol列去重复
deg <- deg[!duplicated(deg$symbol),]
#3.加change列,标记上下调基因
logFC_t=1 #设置阈值
P.Value_t = 0.01 #设置阈值
k1 = (deg$P.Value < P.Value_t)&(deg$logFC < -logFC_t)
k2 = (deg$P.Value < P.Value_t)&(deg$logFC > logFC_t)
change = ifelse(k1,"down",ifelse(k2,"up","stable"))
deg <- mutate(deg,change)
- 筛选出所有差异基因的三种方法
s <- deg[deg$change != 'stable',"symbol"] #找到所有差异基因
s <- deg$symbol[deg$change=="up"] #找到up的基因
library(dplyr)
s <- deg %>% filter(change=="up") %>%
select(symbol)
s <- s$symbol