Primate age- and cell-type-specific METTL7B expression：
灵长类年龄和细胞类型特异性METTL7B表达
在从异皮质到新皮质过渡的海马 ExN 特异性基因中，我们将 CHRNA1 和 METTL7B 鉴定为两个基因，与发育过程中的其他大脑区域相比，在成年海马中显示出时间特异性（图 5C）。 METTL7B 已被描述为主要在肝脏中酶促和代谢活跃的细胞中表达（Uhle ́ n 等人，2015 年）并且尚未在脊椎动物大脑中进行研究，因此我们决定进一步研究其在海马中的可能生物学作用。 METTL7B 编码与内质网 (ER) 和脂滴 (LD) 相关的膜蛋白，根据氨基酸序列同源性，预计属于蛋白质甲基转移酶超家族 (Turro ́ et al., 2006; Thomas et al., 2006)。 , 2013)。
我们绘制了所有分析物种中 METTL7B 的细胞类型表达图，发现 METTL7B 仅在人和猕猴中表达，而在猪或小鼠中不表达（图 6A）。这些结果通过大量组织 RNA-seq、定量 PCR 和蛋白质印迹以及小鼠中的 lacZ 报告基因得到证实（图 6B-6F 和 S5A）。
在人类中，我们观察到 ExNs 中的最高表达，尤其是在 DG 中，其次是 CA2-CA4，然后是星形胶质细胞中的 Sub 和中等表达（图 6A）。在猕猴中发现了相同的表达模式，但在星形胶质细胞中表达更高。人类和猕猴海马组织的免疫标记证实了这些发现（图 6G 和 S5B）。
鉴于人类 MTG 中存在微量表达（图 5B），我们调查了人类新皮层的 11 个区域，并在 5B 层的大锥体神经元（图 S5C 和 S5D）中发现了高水平表达，例如 M1C 中的 Betz 和 Meynert 细胞和 V1C，分别。在猕猴中观察到类似的染色模式，在新皮质和内嗅层 5A 和上层 (L2-L4) 的皮质皮质锥体神经元中 METTL7B 的表达非常少。使用免疫电子显微镜，我们证实并扩展了之前的报告，表明 METTL7B 定位于猕猴和人类海马神经元和星形胶质细胞的 ER 和 LDs（图 6H 和 6I）。
METTL7B 在人类和猕猴中的这种优先表达促使我们扩大分析范围，并在我们的研究中纳入了另一种灵长类动物，分析了人类、黑猩猩和恒河猴 16 个同源大脑区域中的 METTL7B（Sousa 等人，2017 年；Zhu 等人，2017 年)。 黑猩猩大脑中的 METTL7B 表达与人类没有区别，而它在猕猴大脑中的整个大脑中更广泛地上调（图 S5E），这可能归因于星形胶质细胞中的表达升高（图 6A 和 S5B）。 使用已发布的数据集（Cardoso-Moreira 等，2019），我们发现 METTL7B 表达在人类、黑猩猩和猕猴大脑中富集，但在小鼠、大鼠、兔和负鼠的大脑中没有（图 S5F）， 表明该表达及其生物学后果在哺乳动物中并不保守，并且可能是灵长类动物特有的。
6：
METTL7B interacts with proteins associated with the ER, LDs, and AD
METTL7B 与与 ER、LD 和 AD 相关的蛋白质相互作用
为了更深入地了解 METTL7B 在灵长类动物海马体中的可能功能，我们试图通过使用两种不同的基于亲和力的方法进行无偏见的蛋白质组学分析来识别 METTL7B 相互作用蛋白：HaloTag，它几乎没有非特异性结合（Hook，2014） 和 BioID，它能够捕获弱相互作用或瞬时相互作用（Roux 等人，2012 年；图 S6A、S6B、S6G 和 S6H）。 使用相互作用组的显着性分析（SAINT）（Choi 等人，2011），我们在 HaloTag 中鉴定了 275 个 METTL7B 相互作用物，在 BioID 中鉴定了 1,804 个相互作用物（图 S6D 和 S6J；表 S5；STAR 方法）。 两种方法都显示出 ER 和 LD 相关蛋白的显着富集（图 S6E 和 S6K），这也通过共免疫荧光证实（图 S6C 和 S6I）。 KEGG 通路富集分析揭示了与 ER 中的蛋白质加工、氧化磷酸化、内吞作用和神经退行性疾病（包括 AD）的潜在相关性（图 S6F 和 S6L）。
将两种策略中的METTL7B相互作用蛋白质列表交叉，我们发现了110种高置信度蛋白质，其中最丰富的基因本体术语是ER中的蛋白质加工（图7A和7B）。我们观察到许多高置信度蛋白与KEGG AD途径重叠（图7C和S6F），包括淀粉样前体蛋白（APP）、g-分泌酶抑制（RTN3和RTN4/NOGO）和淀粉样结合（NAE1、LRP1和APBB1）。我们使用我们的snRNA seq数据集证实，这些基因中的许多与METTL7B在几个海马群体中广泛共表达（图S7A），随后的免疫印迹证实候选蛋白RTN4、APP和LRP1对METTL7B样本洗脱液具有特异性。在任何样品中均未检测到RTN3，可能是因为下拉量低（图7D和7E）。此外，使用多种独立的方法，包括多个脑区的体组织RNA序列、dlPFC的snRNA序列（Mathys等人，2019）和MTG（STAR方法）以及免疫组织化学（图S7B–S7D），我们发现与对照脑相比，AD脑中表达METTL7B的星形胶质细胞选择性富集，提示随着AD的进展，METTL7B的表达可能参与神经胶质细胞对神经元损伤的反应。
为了确定 METTL7B 的注释甲基转移酶结构域是否表现出甲基转移酶活性，我们在连续酶偶联 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 甲基转移酶测定中将纯化的重组蛋白（RTN4、APP、LRP1 和 RTN3）与重组 METTL7B 一起孵育。 与单独孵育的候选蛋白质相比，所有四个测定样品产生的信号显着增加（图 7F），表明 METTL7B 使用 SAM 作为甲基供体，并且 METTL7B 具有酶活性。 我们进一步表明，这种 METTL7B 介导的甲基化在高水平脂质的条件下可能受到限制，因为在这些条件下 METTL7B 从内质网易位到 LDs，但这些 METTL7B 相互作用蛋白保留在 ER 中（图 7G 和 7H）。 我们的跨物种转录组学分析表明，区域和细胞类型特异性蛋白质甲基化机制似乎仅限于灵长类动物。