今天跟大家分享的是2020年4月发表在frontiers in oncology上的一篇文章，影响因子4.137。这是一篇肿瘤微环境：基质+免疫+ESTIMATE评分的文章，之前也分享过类似的文章哦，看来这个思路还是蛮值得借鉴的嘛。
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肿瘤微环境（TME）在肺腺癌（LUAD）的发生和发展中起着至关重要的作用。然而，在理解TME中免疫和基质成分的动态调节方面仍然存在挑战。该项研究基于基质评分和免疫评分共同筛选与肺腺癌免疫浸润的预后因子，并用实验验证了其表达。先介绍下文章使用的数据和方法吧。
一.材料和方法
1.1原始数据
作者从TCGA数据库下载了551例LUAD病例的转录组RNA-seq数据（正常样品54例;肿瘤样品497例）和相应的临床数据。
1.2 ImmuneScore，StromalScore和ESTIMATEScore的生成
作者使用R语言estimate包中的ESTIMATE算法来估计每个样本在TME中的免疫基质成分的比率，以三种得分的形式展现：ImmuneScore，StromalScore和 ESTIMATEScore，分别与免疫，基质和两者之和呈正相关，这意味着相应分数越高，TME中相应成分的比率就越大。
1.3生存分析
使用R包survminer进行生存分析，用Kaplan–Meier方法绘制生存曲线，将对数秩作为统计显著性检验。
1.4在ImmuneScore和StromalScore的高分和低分组之间生成DEG
作者分别根据与ImmuneScore和StromalScore的中位数，将497个肿瘤样本分为高分组和低分组。使用R包limma进行差异表达分析。
1.5 GO和KEGG富集分析
使用clusterProfiler，richplot和ggplot2软件包，对 379个DEG进行了GO和KEGG富集分析。
1.6热图
通过R语言的pheatmap生成DEG的热图。
1. 7 临床阶段的差异分析
从TCGA中下载LUAD样品的临床病理特征数据。使用R语言进行分析，取决于比较的临床分期数，使用Wilcoxon秩和或Kruskal–Wallis秩和检验作为显著性检验。
1.8 PPI网络的构建
通过STRING数据库构建PPI网络，然后使用Cytoscape进行重构。
1.9 COX回归分析
应用R语言进行单变量COX回归分析。
1.10 基因集富集分析
作者从Molecular Signatures数据库下载了Hallmark和C7基因集集合，进行GSEA分析。
1.11 TICs谱
使用CIBERSORT计算方法估算所有肿瘤样本中的TIC丰度分布，然后进行质量过滤，仅选择421个p <0.05的肿瘤样本进行以下分析。
二.结果展示
2.1这项研究的分析过程
该研究的分析过程如图1所示。
图1.分析流程图
2.2得分与LUAD患者的生存率相关
为了建立估计的免疫和基质的比例与存活率的相关性，分别对ImmuneScore，StromalScore和ESTIMATEScore进行Kaplan-Meier生存分析。ImmuneScore 或StromalScore的评分越高，说明TME中的免疫或基质成分越多。ESTIMATEScore是ImmuneScore和StromalScore的总和，表示TME中两种成分的综合比例。如图2A所示，免疫成分的比例与总生存率呈正相关。尽管StromalScore与总生存率无显著相关性（图2B），但ESTIMATEScore仍与生存率呈正相关（图2C）。这些结果表明，TME中的免疫成分更适合于指示LUAD患者的预后。
图2.分数与LUAD患者生存率的相关性
2.3分数与LUAD患者的临床病理分期有关
为了确定免疫和基质成分的比例与临床病理特征之间的关系，作者从TCGA数据库中分析了LUAD病例的相应临床信息。结果显示，ImmuneScore与TMN期的T分类呈负相关（图3D）；StromalScore仅与TMN期的M分类负相关（图3H），而ESTIMATEScore随TMN期的增加显著下降（图3F和图3I）。这些结果表明免疫和基质成分的比率与LUAD的进展有关，例如侵袭和转移。
图3.ImmuneScore和StromalScore与临床病理分期特征的相关性
2.4 ImmuneScore和StromalScore共同的DEG主要表现为免疫相关基因的富集
为了确定TME中与免疫和基质成分有关的基因表达谱的确切变化，对高分和低分的样本进行了差异分析。从ImmuneScore（高分与低分样本）中获得了总共776个DEG，626基因上调，而150个基因下调（图4A，C，D）。同样，从StromalScore获得了783个DEG，由665个上调基因和118个下调基因组成（图4B–D）。Venn图显示，ImmuneScore和StromalScore中共有317个高分共享的上调基因，还有62个低分共享的下调基因。这些DEG（共379个基因）可能是TME状态的决定因素。接下来的GO富集分析的结果表明，DEG与免疫相关的术语相关（图4E）。KEGG富集分析还显示这些基因还富集于趋化因子信号传导通路，细胞因子-细胞因子受体相互作用和造血细胞谱系（图4F）。因此，DEG与免疫相关，这意味着免疫因子的参与是LUAD中TME的主要特征。
图4.DEG的热图，维恩图以及GO和KEGG的富集分析
2.5 PPI网络与单变量COX回归的相交分析
为了进一步探讨其潜在机制，作者使用Cytoscape软件在STRING数据库的基础上构建了PPI网络。379个基因之间的相互作用显示在图5A中，条形图表示了按结点数排名的前30个基因（图5B）。接下来作者进行了LUAD患者生存率的单变量COX回归分析（图5C）。然后，作者对PPI网络中的关键节点与按单变量COX回归p值排序的前16个因子进行交叉分析，仅CCR2和BTK两个因子与上述分析重叠（图5D）。
图5.蛋白质-蛋白质相互作用网络和单变量COX
2.6 LUAD患者BTK表达与TNM分期及生存率的关系
在这一部分，作者根据BTK中值表达将所有LUAD样本分为BTK高表达组和BTK低表达组。生存分析表明，高表达BTK的LUAD患者比低表达BTK的患者具有更长的生存期（图6C）。接下来作者进行了结合临床特征的BTK分析，Wilcoxon秩和检验表明，肿瘤样本中BTK的表达明显低于正常样本中的表达（图6A）。并且在同一患者的正常组织与肿瘤组织之间的配对分析中观察到了相似的结果（图6B）。这些结果表明，TME中BTK的表达与LUAD患者的预后呈正相关。尤其是，随着TNM分期的进展，BTK的表达下降（图6D-G）。
图6.BTK在样本中的差异表达及其与LUAD患者的生存和临床病理分期特征的关系
2.7 BTK有可能成为TME调制的指标
由于BTK的水平与LUAD患者的生存期和TNM分期呈负相关，作者进行了GSEA分析，结果显示BTK高表达组的基因主要富集免疫相关活性（图7A），对于BTK低表达组，主要富集的是代谢通路，包括糖酵解，氧化磷酸化和典型的肿瘤通路（图7B）。对于MSigDB定义的C7集合，免疫基因集、多个免疫功能基因集在高BTK表达组中富集（图7C）。但是，在低BTK表达组中，几乎没有基因集富集（图7D）。这些结果表明BTK可能是TME状态的一个潜在指标。
图7.高BTK表达和低表达的样本的GSEA分析
2.8 BTK与TIC比例的相关性
为了进一步证实BTK表达与免疫微环境的相关性，作者使用CIBERSORT算法分析了肿瘤浸润免疫亚群的比例，并在LUAD样本中构建了21种免疫细胞谱（图8）。
图8. 肿瘤样本中的TIC概况和相关性分析
差异和相关性分析的结果表明，总共有8种TIC与BTK的表达相关（图9）。其中5种TICs与BTK表达呈正相关，三种TICs与BTK表达呈负相关。这些结果进一步支持了BTK的水平影响TME的免疫活性。
图9.TICs比例与BTK表达的相关性
好啦，文章的思路跟之前发的文章还是很像的，结果得到了分析上和实验上的验证，是一篇典型的干湿结合的研究。今天的分享到这里就结束了，感兴趣的小伙伴要好好学习哦~