原代细胞小核酸转染试剂实验要点

RFect产品特点

◎卓越的原代细胞转染性能：细胞转染阳性率一般在80%以上，基因敲除效果明显，肝细胞Lamin A/C 基因敲除效率在95%以上；

◎极低的细胞毒性：转染细胞死亡率不到10%，大大降低了因细胞毒性对实验结果的影响；

◎转染细胞范围广，绝大多数原代细胞都能获得比较理想的转染结果。

RFect操作步骤：本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。

A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔500 μl培养基，使细胞在转染时密度在30-50%，尽量不要使用抗生素。

B. siRNA-RFectPM混合物准备：

1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。

2. 2μl RFectPM用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。

3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFectPM稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。

C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：

1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。

2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、

所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

转染实验优化: 为了提高转染效率，最好对转染条件进行优化，特别是首次使用。例如：24孔培养板，调整 siRNA与RFectPM试剂的用量。siRNA用量在0.6-30 pmol (final concentration 1- 50 nM)之间调整，RFectPM试剂用量在1.0 - 3.0μl之间调整。

转染实验要点

l 转染过程尽量不要使用抗生素，否则会导致细胞死亡增加；

l 首次实验siRNA的用量设置在终浓度10nM、30nM、50nM、100 nM进行摸索 ，后续实验根据实验结果修改。