基因组与转录组，深入挖掘基因表达信息--03

案例6

研究背景

    性二态(Sexual dimorphism) 一直是进化生物学家关注的热点问题。两栖动物具有丰富的性二态特征，繁殖期的雄性雷山髭蟾在上颌的皮肤形成角质刺，而雌性则没有这种特征。除性染色体上的基因外，大多数的基因组在雄性和雌性之间是共享的，所以性二态往往是由基因在性别间差异性表达引起的。由于缺乏参考基因组，很少有研究能够将性别差异表达模式与特定的性二态特征联系起来，与性二态性状相关的重要生物学过程和关键基因也一直难以破解    。

方法流程

研究结果

雷山髭蟾基因组的组装注释及结构特征分析

作者通过三代+HiC技术组装出3.54 Gb基因组，contig N50为1.93 Mb, scaffold N50为395 Mb。雷山髭蟾具有77.1%的重复序列，高于大多数已完成测序的无尾目物种，基因组共线性硏究表明雷山髭蟾和热带爪蟾X.tropicalis存在着大量的染色体共线性，雷山髭蟾的染色体分裂导致两者间染色体数目的差异。

比较基因组分析

    作者利用雷山髭蟾基因组与其它六种无尾目动物比较基因组分析，通过单拷贝直系同源基因进行进化树的构建，七个无尾目物种最近的共同祖先(MRCA)估计发生在2.101亿年前(176.2-248.8 Ma), L. leishanense 与新蛙亚目的物种在约185.9 Ma发生分化。与MRCA相比，L. leishanense共有107个基因家族显著扩张，扩张家族的基因主要富集于信号反应类型，包括嗅觉、刺激反应、信号转导、细胞增殖、凋亡、免疫反应、角质化组织形成相关生物学过程。

转录组分析及qPCR验证

    为了研究L.leishanense中与角质刺性二态相关的生物学过程，作者对两种性别和三个发育阶段(亚成年 期、繁殖期、繁殖后期)的上颌皮肤(MS)进行了转录组测序，同时以背部皮肤(DS)转录本作为对照。并对来自大脑和性腺的转录组数据进行了测序。分析发现雄激素，甲状腺激素(TH),催乳素(PRL)和松弛素(RLN)可能参与性二态调节。

两种性别和三个发育阶段的基因共表达分析

    为了进一步确定控制角质刺生长的关键基因，研究者分析了基因共表达网络，并使用加权基因共表达网络分析(WGCNA)鉴定了基因模块(genetic module),共表达网络揭示了Wnt通路、角蛋白基因krt、黑色素合成相关的酪氨酸酶基因tyr以及转录因子hoxc13等参与形成角质刺结构。

总结

    本文以雷山髭蟾为研究对象，建立了一个具有代表性的锄足蟾亚目基因组。这项研究不仅提供了一个高质量的两栖动物基因组，并揭示了雷山髭蟾角质刺产生的分子基础。对于深入理解脊椎动物性二态形成及调控的分子机制具有重要意义，类似的分子调控模式也为今后两栖动物皮肤起源的性二态研究提供指导。

案例7

研究背景

团头鲂(BSB)和翘嘴鲌(TC)均为重要的鲤科淡水鱼，它们有着相同的染色体条数(2n=2x=48),两者虽然属于不同属种，但是可以正常杂交，并且正反交子代表现出差异的表型，同时杂交子代在生长速度、抗病性等方面都优于其父母本。物种杂交和多倍化常会引起基因的聚合，从而形成大量等位基因，杂交子代和多倍体中的等位基因在表达时会出现表达的偏好性以及表达显性效应，而对这种等位基因的不对称表达的研究还未深入。

方法流程

研究结果

团头鲂(BSB)和翘嘴鲌(TC)基因组组装注释和基因组进化

    结合二代、PacBio SMRT测序、Hi-C以及遗传图谱等技术，组装得到了团头鲂雌鱼(基因组大小1.09 Gb,contig N50 142.73 kb, scaffold N50 1.40 Mb)和翘嘴鲌白雄鱼(基因组大小1.02 Gb, contig N50 72.24 kb, scaffold N50 3.67Mb)的基因组，并注释到30000个左右基因。

基因组进化

    比较基因组分析发现，团头鲂和翘嘴鲌的祖先与草鱼于27.35百万年前分化，而团头鲂和翘嘴鲌的分化时间在12.74百万年前。同时在两者基因组中发现大量扩张和收缩的基因家族，其中包括多个与骨骼发育和骨骼肌功能相关的基因。并发现部分与免疫响应、生长发育有关基因受到正向选择作用。

等位重组基因分析

    研究人员对团头鲂、翘嘴鲌以及两者正反交连续3个世代的杂交子代(BTF1-BTF3和TBF1-TBF3)进行RNA测序(亲本和各世代子代均3个重复)。通过亲本同源基因特 异的SNP，研究人员在不同世代的杂交子代中检测到许多发生等位重组的基因，而且在TB家系中，等位重组基因从F1-F3世代表现出递增的规律。同时研究人员借助三代全长转录测序和Sanger测序验证了RNA测序得到的等重组基因的真实性。

表达的显性效应

    比较了连续杂交子代和双亲同源基因的表达量水平，发现杂交子代和双亲之间存在不同程度的差异表达基因，而且在不同世代间存在一定的差异，总体而言，杂交子代与翘嘴鲌间差异表达基因的比例相对较小，说明翘嘴鲌的等位基因表现出显性效应(dominance)。随着两个家系世代的延续，“表达显性(domi- nance)”种“加性表达(additive)”的基因数在逐渐增加，表现出强烈的去亲本效应。

表达的多样性和偏好性

    除了分析等位基因整体的表达水平，研究人员还分析了双亲来源的等位基因的表达水平，发现更多基因表现出团头鲂等位基因表达的偏好性，但随着杂交世代的延续，双亲等位基因表达量逐渐接近，即等位基因表达的偏好性消失。鲂鲌不同世代子代等位基因差异表达的各类遗传效应在不同世代子代间作用强度是有差别的，表现出强烈的去亲本效应。各子代等位基因表达与鲂鱼白物种间进化有一定的相关性。

总结

    作者结合组装的团头鲂和翘嘴鲌的基因组数据和正反交子代的转录组测序信息，分析了亚基因组间等位基因的重组转录本，同时为了阐明异源二倍体连续世代的转录调控，作者还分析了其表达模式。最终，早期杂交世代的等位重组和不对称表达的联合效应为杂交后脊椎动物基因组的进化提供了新的见解。

参考文献