移动终端花1决定了拟南芥种子的大小
摘要
种子大小是连接植物有性繁殖和后续幼苗建立的关键农艺性状，受双施肥后胚乳增殖后胚乳纤维素化时间的影响。到目前为止，控制胚乳细胞化时间的分子开关在很大程度上是不清楚的。在这里，我们报道了拟南芥终端花1 (TFL1)是在合点胚乳中产生的一种可移动调节因子，它通过稳定脱落酸不敏感5（ABSCISIC ACID INSENSITIVE 5）而移动到合胞外周胚乳中，及时介导胚乳纤维素化和种子大小。我们进一步证明，ras相关的核GTPases与TFL1相互作用，并调节其转运到合胞体外周胚乳。我们的研究结果表明，TFL1是调控胚乳细胞化和种子大小的重要分子开关。在靠近母株维管组织的合点胚乳中产生可移动TFL1，为母株控制种子发育提供了一种迄今为止尚不清楚的手段。
种子的发育决定了开花植物的进化适应性和作物产量。在种子发育的各种生长参数中，种子大小与种子萌发的养分水平和幼苗建立过程中对非生物胁迫的耐受性密切相关。因此，在许多作物的驯化和育种过程中，种子大小始终是重要的农艺性状。到目前为止，对模型植物拟南芥种子大小控制的了解已为分子育种改善作物提供了重要的观点。拟南芥种子发育开始于胚乳和珠皮的快速生长，形成大的种子腔，然后胚乳被胚所取代。种子腔的体积是影响种子最终大小的重要因素，它在空间上限制了胚的生长。胚乳细胞化后，珠皮伸长和胚乳扩张通常终止，细胞化定义了可用的空腔空间，使种子在随后的胚扩大过程中保持几乎相同的大小。因此，最终种子的大小受到胚乳细胞化时间的严格控制，而胚乳细胞化的中断通常与种子大小的变化有关，如IKU通路中调节因子的突变。在该途径中，HAIKU1(IKU1)、HAIKU2 (IKU2)和MINISEED3(MINI3)功能缺失，胚乳细胞化早熟，导致种子表型小，而下胚轴短功能缺失BLUE1（SHORT HYPOCOTYL UNDER BLUE1） (SHB1)，导致胚乳细胞化延迟，种子大。此外，脱落酸(ABA)被发现通过ABA不敏感5(ABI5)调节SHB1转录，影响胚乳细胞化的时间，并负向调节种子大小。在精子核与双核中央细胞受精后，产生的初生胚乳核经历了没有细胞质分裂的有丝分裂，产生合胞胚乳，它在空间上分为三个区域;微孔，合点和外周胚乳。微孔胚乳围绕在胚和胚柄周围，合点胚乳位于与胚相对的合点极。在种子发育的最初阶段，外周胚乳在中央大液泡的作用下作为外周层扩散。经过8轮合胞体分裂后，微孔和外周胚乳随后发生细胞化，而合点胚乳始终保持合胞状态。超微结构研究表明，合点胚乳靠近母体的血管组织，在营养物质或信号的摄取、再加工和运输中起着胚乳吸器的作用。尽管有这些研究，但合点胚乳在种子发育中的作用的分子机制仍然完全未知。
在本研究中，我们报道了终端花1 (TFL1)，一种磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族成员，先前在拟南芥中被称为芽识别基因，通过调节适当的胚乳纤维素化时间，在决定种子大小方面发挥了重要作用。我们证明了一组小的gtp结合ras相关核蛋白(RAN)介导了TFL1蛋白从合点胚乳向合胞外周胚乳(SPE)的转运，在SPE中TFL1稳定ABI5，从而介导了胚乳和种子的及时纤维素化。
结果
TFL1功能缺失突变体表现出较大的种子表型。在研究TFL1调控花序的过程中在拟南芥的结构中，我们发现其功能缺失突变体tfl1-1和tfl1-20表现出明显的变异大种子表型(图1a,b)，
图1 | TFL1影响种子大小。 a，tfl1突变体，TFL1：GUS和各种基因组TFL1（gTFL1）构建体的示意图。倒三角形或箭头分别指示T-DNA插入位点（tfl1-20）或甲磺酸乙酯突变位点（tfl1-1）。外显子，内含子和非翻译区分别由黑色，灰色和白色框表示。其他基因组区域用黑线表示。相对于翻译起始密码子的第一个核苷酸编号为+1的核苷酸序列
图1b，野生型（WT），tfl1-20和tfl1-1植物成熟干种子的比较。比例尺，500μm。
这与成熟胚的尺寸增大有关(图1c)。
WT，tfl1-20和tfl1-1植物成熟胚的比较。比例尺，500μm。 b，c中的实验独立进行了三次，结果相似。
进一步检查转移- dna(T-DNA)插入突变体的种子中，tfl1-20揭示了种子大小的主要参数，包括种子面积、周长、长、宽、长/宽和种子质量显著与野生型种子相比，tfl1-20增加(图1d)，
WT和tfl1-20植物种子大小和质量的定量分析。箱形图显示了500 WT和tfl1-20种子的种子大小参数（面积，周长，长度，宽度和长度/宽度比）的中位数（线），四分位数范围（框）和晶须（扩展1.5倍四分位数范围）。种子质量是五个样本批次的平均值，每个样本包含500个种子。
而tfl1-20的每角果粒数与野生型植物相当(补充图1a,b)。
扩展数据图1 | gTFL1-3HA和gTFL1-GFP可以挽救tfl1-20的早期开花和末端花表型。 a，tfl1-20比野生型（WT）植物和独立的tfl1-20 gTFL1-3HA或tfl1-20 gTFL1-GFP转基因株系早开花。 b，独立的tfl1-20 gTFL1-3HA和tfl1-20 gTFL1-GFP转基因品系像WT植物一样发育正常的花序顶端，而tfl1-20则发育顶生花（a）。比例尺，2厘米。
为了证实TFL1 -20大种子表型归因于TFL1功能的丧失，我们将TFL1 -20转化为含有a的gTFL1-3HA和gfp的基因组构建8.41-kb TFL1基因组片段，包括2.74-kb的5 '上游序列，4.63-kb 3 '下游序列，以及整个序列1.04 kb编码区域与3HA或绿色荧光框融合蛋白(GFP)标签分别位于终止密码子标签之前(图1a)。绝大多数tfl1-20 gTFL1-3HA和tfl1-20 gTFL1-GFP的独立转子表现出与野生型植株相似的种子表型(图1e)。
基于a3：1孟德尔分离比，对可能在单个位点包含转基因的代表性tfl1-20 gTFL1-3HA和tfl1-20 gTFL1-GFP系的种子大小参数进行定量分析。箱形图显示了不同基因型（tfl1-20，n = 148; WT，n = 106; tfl1-20）种子的种子大小参数的中位数（线），四分位间距（框）和晶须（扩展1.5×四分位间距） gTFL1-3HA 1、2、4号分别为n = 100、102、106; tfl1-20 gTFL1-GFP 1、2、3号分别为n = 108、126、131）。选择红色框突出显示的线以进行进一步分析。在框图中显示了相对于设定为100％的WT植物平均值的特定基因型种子参数的百分比变化（％）。 d，e中的星号表示tfl1-20与其他基因型之间存在显着差异（用于种子质量比较的两尾Student t检验；用于其他比较的两尾Mann-Whitney检验，P <0.0001）。在d，e中，种子大小参数的所有P值均小于1×10-15，而在d中，种子质量的P值为4.67×10-13。
此外，gTFL1-3HA和gTFL1-GFP也完全挽救了tfl1-20的其他发育缺陷，包括早花和终花表型(扩展数据图1a,b)。这些结果表明，TFL1与TFL1 -20中观察到的种子大小表型有关，而gTFL1基因组片段包含了TFL1活性所需的必要调控元件。我们进一步为tfl1-20 gTFL1-3HA和tfl1-20 gTFL1-GFP分别选择了一个代表性株系(图1e)，根据3:1的孟氏分离比，该株系可能包含在单个位点的转基因，以供进一步研究。
TFL1通过影响胚乳细胞化来确定种子大小。对tfl1-20和野生型种子进行授粉后1至7 d的组织学分析（DAP）显示，它们的胚胎发育进展相似（图2a和扩展数据图2a），而它们的种子腔却变得不同 在球状阶段后第3天DAP更明显（图2a，b）。
扩展数据图2 | TFL1影响胚乳细胞化。 a，在授粉后1、2和6天，清晰的野生型（WT）和tfl1-20植物的整粒种子的微分干涉对比（DIC）显微镜。比例尺，50μm。该实验独立地重复了三遍，结果相似。
图2 |胚乳细胞化在tfl1-20中被延迟。 a，在DAP，3、4、5和7处清晰的野生全野生型（WT）和tfl1-20种子的DIC显微镜检查。比例尺，50μm。 b，在1–7 DAP时WT和tfl1-20种子腔面积的比较。在每个时间点检查随机选择的种子（WT种子在1-7 DAP，n = 15、11、12、12、14、13和9； tfl1-20种子在1-7 DAP，n = 12，n = 12 12、10、14、13、11和9）。值是平均值±s.d。每天的WT平均值设置为100％。星号表示统计学上的显着差异（两尾学生t检验，P <0.01）。 NS，不显着。1–7 DAP的P值分别为0.628、0.811、0.313、8.99×10-3、1.11×10-7、4.31×10-8和7.75×10-8。
从4 DAP球心过渡期开始，tfl1-20的种子腔明显大于野生型种子(图2b)，这与tfl1-20与野生型种子的尺寸差异一致(图2a及扩展数据图2a)。
由于tfl1-20在4 DAP时可以检测到种子腔表型的增大，我们通过监测戊二醛固定胚乳细胞产生的自发荧光，对3 - 5 DAP时tfl1-20和野生型种子的胚乳发育进行共聚焦显微镜分析。值得注意的是，野生型外周胚乳在过渡期(4 DAP)进行了细胞化，而在tfl1-20种子中，胚乳细胞化延迟到心脏期(5 DAP)(图2c和扩展数据图2b)。此外，对过渡期石蜡包埋的种子进行组织学分析(4 DAP)也发现，只有野生型的外周胚乳部分细胞化，而tfl1-20的种子没有(图2d)。
c，通过共聚焦显微镜比较在3–5 DAP下清除的全野生WT和tfl1-20种子的外围胚乳发育。通过戊二醛处理产生自发荧光（绿色荧光）信号。箭头指示胚乳细胞化过程中的新细胞壁。合并，合并绿色荧光和明场图像。比例尺，50μm。
b，通过共聚焦显微镜检查在3至5 DAP时WT和tfl1-20中具有合胞体或细胞化的外围胚乳的种子的百分比。在每个时间点检查从每种基因型的10个以上角果中随机选择的种子。
d，在4 DAP时WT和tfl1-20种子的组织学分析。 CPE，细胞化的外围胚乳；CV，中央液泡; CZE，合点端； EM，胚芽。比例尺，50μm。
这些观察结果表明，与野生型种子相比，tfl1-20的胚乳细胞化延迟。
TFL1蛋白是种子发育过程中的一个移动信号。为了了解TFL1是如何影响胚乳纤维素化和种子大小的，我们对从野生型植物的不同组织中提取的总RNA进行了实时荧光定量PCR分析。TFL1信使RNA (mRNA)几乎在叶片中表达最低的所有组织中普遍表达，而在发育中的角突中，TFL1信使RNA (mRNA)在过渡期前表达降低(4 DAP)，在过渡期后表达增加(扩展数据图3a)。
扩展数据图3 | TFL1 mRNA和蛋白在拟南芥中的表达。 a，拟南芥授粉后2至7天（DAP；下图）在各种组织（上图）或发育中的角果树中TFL1 mRNA表达的实时定量PCR分析。 OF，开花； IS，花序茎； RL，莲座叶； Rt，根；sil：长角果； CL，茎生叶； FB，花蕾。将结果相对于作为内部对照的U-BOX基因的表达水平进行了标准化。下部面板中的表达水平显示为相对于设置为1的2 DAP水平的相对值。值是三个生物学重复的平均值±SD。
对正在发育的种子进行原位分析发现，TFL1 mRNA在合点胚乳中特异表达，而在过渡阶段的SPE中没有特异表达(图3a和扩展数据图3b)。
图3 | TFL1 mRNA和蛋白质在发育中的种子中的定位。 a，使用TFL1反义或有义探针，在发育中的种子中DFL在4个DAP（左两图）和4.5（右两个图）DAP中原位定位。比例尺，100μm。
b，使用TFL1反义或有义探针在4 DAP发育种子中TFL1表达的原位定位。 SPE，合胞体周围胚乳； CZE，合点端。比例尺，100μm
我们进一步构建了TFL1:葡萄糖醛酸苷酶(GUS)报告基因结构，其中GUS基因在用于基因互补试验的TFL1基因组片段中包含的相同的5个上游和3个下游序列之间融合(图1a)。在过渡阶段种子合点胚乳中再次检测到强烈的GUS信号(图3b)。
b，在4DAP时TFL1：GUS种子的GUS染色。比例尺，100μm.c，拟南芥eFP浏览器中显示的公共微阵列数据中TFL1在种子中的表达模式
这些结果，加上拟南芥eFP浏览器中公共芯片数据分析的TFL1表达模式(图3c)，显示了TFL1 mRNA在合点胚乳中的特异性表达。
为了检验TFL1蛋白在发育中的定位，我们利用建立的TFL1- 20 gTFL1-GFP转基因株系(图1a)，其中TFL1- gfp能够挽救TFL1- 20的多效缺陷(图1e和扩展数据图1)。共聚焦显微镜分析检测到在花序、芽顶端分生组织和根韧皮部组织中存在TFL1-GFP信号(扩展数据图3c,d)，如之前的研究所示，表明可追踪的TFL1-GFP具有体内生物学功能。
c，d，TFL1-GFP在花序分生组织（c）和tfl1-20 gTFL1-GFP的根（d）中的定位。合并，合并GFP和明场图像。比例尺，20μm。
在SPE中可以大量检测到TFL1-GFP蛋白，但在发育中的种子的合点胚乳中只能检测到微弱的TFL1-GFP蛋白(图3d和扩展数据图3e、f和4a)。
d，通过冷冻切片在4 DAP处将tfl1-GFP定位在发育中的tfl1-20 gTFL1-GFP种子中。在SPE（上图）中可以观察到TFL1-GFP信号。下面板是上面显示的SPE的特写视图。具有增强的荧光强度的相应图像在图3e的扩展数据中示出。 BF，明场图像；Merge，合并GFP和BF图像。比例尺，50μm。
e，与图3d所示相比，在增强的荧光强度下，通过冷冻切片在4 DAP下Tfl1-GFP在发育中的tfl1-20 gTFL1-GFP种子中的定位。 TFL1-GFP信号在睑板胚乳中比在合胞体周围胚乳中弱得多（上图）。下面板是上面所示的合点端胚乳及其附近合胞体周围胚乳的特写视图。 BF，明场图像。 CZE，合点端； EM，胚胎； GFP和BF图像的合并，合并； SPE，合胞体周围胚乳。比例尺，50μm。
f，在4 DAP时检测野生型种子中的背景绿色荧光信号。该图像是在与图1相同的条件下获得的。图3d用作图3d的阴性对照。自身荧光（绿色荧光）信号几乎可以检测到。比例尺，50μm。
TFL1定位在SPE的透射电子显微镜进一步证实tfl1-20 gTFL1-3HA转基因线(图3 e和扩展数据图4 c)
e，使用抗HA抗体通过免疫金电子显微镜分析tfl1-20 gTFL1-3HA（左图）相对于野生型（WT，右图）种子在4 DAP的外周胚乳中的TFL1-3HA定位。中间面板是左侧面板中所示框内区域的更高放大倍数。箭头指示金颗粒。比例尺，2μm。
使用抗HA抗体通过免疫金电子显微镜对tfl1-20 gTFL1-3HA种子在4 DAP的合胞体外周胚乳中的TFL1-3HA细胞质定位进行分析。下面板显示了上面板指示的框内区域的更高放大倍数。箭头指示金颗粒。原子核中没有可检测到的金颗粒。cv，中央液泡; iCW，ii1的细胞壁； ii1，内被膜的最内层细胞层（内皮细胞）；
,其中TFL1-3HA获救的多向性的缺陷TFL1 - 20(图1 e和扩展数据图1),并被使用anti-HA抗体免疫印迹分析(扩展数据图3 g)。
g，选择的tfl1-20 gTFL1-3HA转基因株系中的TFL1-3HA蛋白（箭头）的蛋白质印迹分析，根据其分离比例可能包含一个T-DNA插入位点。从年轻的长角果中提取总蛋白，并使用抗HA抗体进行蛋白质印迹分析。
我们还注意到，TFL1-GFP定位在合胞体或发育中的种子中每个胚乳核周围密集的细胞质中积累的细胞化的外围胚乳（图3d和扩展数据图3e和4a–c），
扩展数据图4 | TFL1在拟南芥中的细胞质定位。 a，b，通过冷冻切片在授粉后（DAP）第4（a）和5（b）天，用DAPI染色的发育中的tfl1-20 gTFL1-GFP种子中TFL1-GFP的定位。合胞体（a）和细胞化（b）外围胚乳中的TFL1-GFP信号与DAPI染色不共定位。 （a）或（b）中每个图中的插图分别显示了合胞体或细胞化的外围胚乳的一个扩大的核。 DAPI，4,6-二氨基-2-苯基吲哚的荧光； BF，明场图像；Mwege，合并GFP，DAPI和BF图像。比例尺，50μm。
在花序分生组织细胞这是一致的。
对TFL1- 20 gTFL1-3HA 长角果中提取蛋白的TFL1- 3HA进行进一步免疫印迹分析，证实TFL1特异性定位于细胞质中(图3f)。
f，通过细胞分级测定法显示了TFL1的亚细胞定位。使用抗HA抗体进行了蛋白质印迹分析，以检查从tfl1-20 gTFL1-3HA年轻小果提取的核（N）或细胞质（C）级分中的TFL1蛋白。与细胞溶质部分相比，核部分过量十倍。用丽春红S染色的RbcL和使用抗组蛋白3（H3）的免疫印迹分析分别用作细胞溶质和核级分的指标。 iCW，ii1的细胞壁； ii1，内被膜的最内层细胞层（内皮细胞）； PSV，蛋白质储存液泡。
这些对发育中的种子的表达分析表明，TFL1 mRNA在合点胚乳中特异表达(图3a c和扩展数据图3b)，其蛋白在SPE的细胞质中大量表达(图3d,e和扩展数据图3e和4a,c)。
RAN蛋白是TFL1的潜在介质。为了深入了解TFL1在合胞体胚乳内转运的分子机制，我们进行了免疫沉淀质谱(IP MS)和下拉质谱(PD MS)分析，以确定种子中TFL1的相互作用同伴。用抗ha抗体免疫沉淀tfl1-20 gTFL1-3HA角果总蛋白提取物进行IP MS，用重组蛋白MBP-TFL1拉低其在野生型角果总蛋白提取物中的相互作用蛋白进行PD MS。从两种方法获得纯化物然后通过液相色谱分析与串联质谱仪（LC-MS / MS）结合使用。这鉴定出了两个多肽(LVIVGDGGTGK和NLQYYEISAK)(图4a)，
图4 | TFL1与RAN蛋白相互作用。 a，通过PD-MS或IP-MS方法确定的TFL1交互伙伴。所鉴定的RAN肽具有高可信度，显示在相应的质谱图上方
它们位于三个推测的Ran GTPases RAN1-3(图4b和补充图2）
b，RAN1，RAN2和RAN3的氨基酸序列相似性。如a所示，可以通过PD-MS（肽1）和IP-MS（肽2）检测到蓝色突出显示的区域。框出的区域表示RAN1，RAN2和RAN3中的可变C末端。从0到+1的相似度表示最低到最高的序列同源性。
中氨基酸序列100%的保守区域，参与核浆转运，具有高度的序列相似性。
为了了解RAN基因的生物学功能，我们从拟南芥生物资源中心获得了RAN2的RAN2 -1、RAN3的RAN3 -1、RAN3 -2 3个T-DNA插入株(扩展数据图5a)。由于RAN2 -1和RAN3在RAN3 -1和RAN2 -1中几乎检测不到RAN2和RAN3(扩展数据图5b)，我们使用这两株进行进一步的表型分析。
扩展数据图5 |分离RAN1，RAN2和RAN3功能丧失的突变体。 a，示意图，显示了RAN1，RAN2和RAN3基因组区域，以及CRISPR-Cas9靶位点（ran1-3和ran1-4）或T-DNA插入位点（ran2-1，ran3-1和ran3-2）。
b，定量分析其相应的T-DNA插入突变体中的RAN2或RAN3表达。将结果相对于作为内部对照的U-BOX基因的表达水平进行了标准化。值是三个生物学重复的平均值±SD。
虽然RAN1 -1和RAN1 -2这两个T-DNA插入位点位于RAN1的5 '启动子区域的突变体已经被报道，但这两个突变体中RAN1的表达仅部分下调。因此，我们利用聚集规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9 (Cas9)技术对RAN1进行了靶向突变。由于RAN1和RAN2在5号染色体上物理连接(扩展数据图5a)，我们分别在野生型和RAN2 -1背景中创建了RAN1 -3和RAN1 -4。RAN1 -3和RAN1 -4分别在第2外显子和第5外显子开始的1-bp胸腺嘧呤(T)插入处进行了短的缺失，导致RAN1蛋白RAN域25的特征被破坏(扩展数据图5a,c,d)。
c，d，在野生型（c）和ran2-1（d）背景中，CRISPR / Cas9介导的RAN1的靶诱变。上图中的下划线标出了RAN1中的CRISPR / Cas9目标位点。新创建的ran1-3单突变体（c）和ran1-4 ran2-1双突变体（d）在RAN1的第二个外显子处含有短缺失，在第5个外显子的开始处含1-bp胸腺嘧啶（T）（均以黑框突出显示）。指出了RAN1蛋白中ran1-3和ran1-4 ran2-1中突变的位置。
这些突变体对应于RAN1中CRISPR / Cas9靶位点的RAN2和/或RAN3序列在ran1-3和ran1-4 ran2-1中保持不变（补充图3），表明CRISPR / Cas9介导的靶诱变特异性修饰了RAN1中的RAN1序列。
在ran1-3、ran2-1和ran3-1单突变体中，ran2-1种子大小参数较野生型种子变化微弱(扩展数据图5e)，而ran2-1种子大小表型在ran1-4和ran3-1背景下进一步增强(图4c)。
e，ran1-3，ran2-1和ran3-1种子大小参数的定量分析。箱形图显示了不同基因型种子的种子大小参数（面积，周长，长度和宽度）的中位数（线），四分位数间距（框）和晶须（延伸四分位数间距的1.5倍）（WT，n = 692； ran1-3，n = 153； ran2-1，n = 516； ran3-1，n = 461）。值代表突变体的种子参数相对于设定为100％的WT植物平均值的百分比变化（％）。星号表示野生型植物与其他基因型之间存在显着差异（两尾曼恩-惠特尼检验，P <0.0001）。 n.s，无统计学差异。对于种子区域，WT与ran1-3，ran2-1和ran3-1的P值分别为0.000193，<1×10-15和0.461。种子周长分别为0.0463、4.378×10−7和0.988；种子长度分别为0.0333、0.800和2.43×10-6;种子宽度分别为0.000409，<1×10-15和0.000164
c，对双突变体种子大小参数的定量分析。箱形图显示了不同基因型（野生型（WT），n = 692； ran1-4 ran2-1，种子号）的种子大小参数的中位数（线），四分位数范围（框）和晶须（扩展了1.5倍四分位数范围） n = 395； ran2-1 ran3-1，n = 647）。显示了相对于设定为100％的WT植物平均值的双重突变体的种子参数的百分比变化（％）。每个框上方标出了双突变体相对于WT的百分比增加。星号表示野生型植物与其他基因型之间的显着差异（两尾曼恩-惠特尼检验，P <0.0001）。 WT和ran2-1 ran3-1之间的种子长度的P值为4.44×10-11，而其他P值均小于1×10-15。
这些突变体的组合没有产生RAN1-3的纯合三重突变体，说明它们在生殖发育或种子发育中都起着重要的作用。此外，RAN1-3在几乎所有被检测组织中普遍表达，但RAN2表达水平明显高于RAN1和RAN3(扩展数据图6a)。
扩展数据图6 |分析RAN1，RAN2和RAN3表达模式。 a，定量分析授粉后2至7天（DAP，下图）中各种组织（上图）或正在形成的长角果中RAN1，RAN2和RAN3表达的定量分析。 OF，开花； IS，花序茎； RL，莲座叶； Rt，根；sil，长角果； CL，茎生叶； FB，花蕾。将结果相对于作为内部对照的U-BOX基因的表达水平进行了标准化。下部面板中的表达水平显示为相对于设置为1的2 DAP水平的相对值。值是三个生物学重复的平均值±SD。
这些观察结果表明，尽管RAN1-3在影响种子大小和可能的其他发育过程中起着多余的作用，但RAN2可能是一个相对重要的角色。 因此，我们选择RAN2作为代表性的RAN基因，以研究其在随后的实验中对种子大小的介导作用。为了了解RAN2蛋白在发育中的表达情况，我们创建了表达4.9 kb RAN2基因组片段的GUS- gran2报告基因系，其中包含2.2 kb - 5的上游序列，GUS报告基因翻译融合到1.6 kb - RAN2编码区和1.1 kb - 3的下游序列。大多数GUS-gRAN2报告株在发育完整的种子中显示了相似的染色模式(扩展数据图6b)，
b，在1至5个DAP时GUS-gRAN2种子的GUS染色。比例尺，50μm。该实验独立地重复了三遍，结果相似。
包括TFL1定位的SPE。
RAN蛋白介导TFL1向SPE的转运。之后我们使用各种方法对TFL1和RAN2之间的交互进行了详细的分析。下拉实验表明，从35S中提取的TFL1-4HA:TFL1-4HA siliques结合到vitro-翻译的MBP- ran2蛋白上，但不结合MBP本身(图4d)。
d，TFL1和RAN蛋白之间相互作用的下拉分析。 MBP和MBP-RAN1 / 2/3用作诱饵，并用Ponceau S（下图）对相应的上样对照进行染色。使用抗HA抗体通过免疫印迹分析检查了从35S：TFL1-4HA片段提取的猎物蛋白TFL1-4HA的输入及其相应的下拉信号（上图）。
TFL1-4HA与MBP-RAN1或MBP-RAN3之间存在类似的相互作用(图4d)。进一步对TFL1和各种RAN2截断蛋白之间的相互作用进行拉下分析，发现RAN2中与蛋白相互作用有关的效应结合结构域的缺失，部分影响了它们的相互作用(扩展数据图7a,b)。
扩展数据图7 | TFL1与RAN2的显性阴性（DN-ran2）或截短形式之间的相互作用的下拉分析.a，与MBP融合的DN-ran2和RAN2截短（Del1-Del3）蛋白的示意图。全长RAN2蛋白包含与蛋白-蛋白相互作用有关的效应子结合结构域和酸性C-末端结构域。 DN-ran2蛋白在残基27处含有苏氨酸（T）突变为天冬酰胺（N），其位于RAN2的效应子结合域附近。 b，下拉测定结果。 MBP和各种MBP融合蛋白用作诱饵，并用Ponceau S（下图）对相应的上样对照进行染色。使用抗-HA抗体通过免疫印迹分析检查了从35个S：TFL1-4HA片段中提取的猎物蛋白TFL1-4HA的输入及其相应的下拉信号（上图）。该实验独立地重复了三遍，结果相似。
为了研究TFL1和RAN2在体内的相互作用，我们生成了RAN2- 1 gRAN2-3FLAG转基因植株，其中3FLAG与GUS-gRAN2的相同RAN2基因组片段融合，挽救了RAN2- 1的种子大小表型。对ran2- gRAN2-3FLAG tfl1- 20 gTFL1-3HA 长角果总提取物的共免疫沉淀(CoIP)分析证实了RAN2-3FLAG和tfl1- 3ha之间的体内相互作用(图4e)。
e，CoIP显示的拟南芥果蝇中TFL1-3HA和RAN2-3FLAG之间的体内相互作用。用抗HA抗体免疫沉淀WT或tfl1-20 gTFL1-3HA背景下ran2-1 gRAN2-3FLAG的年轻小种的总蛋白提取物。使用抗HA（下图）或抗FLAG（上图）抗体通过免疫印迹分析检查输入的和共免疫沉淀的蛋白质。
这些结果表明在种子中TFL1与RAN2相互作用。
与tfl1-20相比(图1b d)， RAN1-3的单、双突变体的种子大小表型相对较弱(图4c和扩展数据图5e)，而纯合的三重突变体则无法存活。
e，ran1-3，ran2-1和ran3-1种子大小参数的定量分析。箱形图显示了不同基因型种子的种子大小参数（面积，周长，长度和宽度）的中位数（线），四分位间距（框）和晶须（延伸四分位间距的1.5倍）（WT，n = 692； ran1-3，n = 153； ran2-1，n = 516； ran3-1，n = 461）。值代表突变体的种子参数相对于设定为100％的WT植物平均值的百分比变化（％）。星号表示野生型植物与其他基因型之间的显着差异（两尾曼惠特尼检验，P <0.0001）。 n.s，无统计学差异。对于种子区域，WT与ran1-3，ran2-1和ran3-1的P值分别为0.000193，<1×10-15和0.461。种子周长分别为0.0463、4.378×10-7和0.988；种子长度分别为0.0333、0.800和2.43×10-6;种子宽度分别为0.000409，<1×10-15和0.000164。
为了研究RAN蛋白在TFL1上可能的冗余效应，我们创建了gDN-ran2-3FLAG转基因株系，在该株系中，RAN2的27个残基上的苏氨酸 (T)突变为天冬酰胺（N）与3FLAG翻译的RAN2基因组片段融合。这产生了RAN2的显性阴性版本(DN-ran2)(扩展数据图8a)，
扩展数据图8 | gDN-ran2-3FLAG（gDN）和TFL1：3FLAG-DN-ran2（TFL1：DN）转基因植物的种子大小表型。 a，b，gDN（a）或TFL1：DN（b）转基因株系中DN-ran2蛋白表达的蛋白质印迹分析。使用抗FLAG抗体分析了从长角果中提取的总蛋白。星号表示非特异性条带。
如前所述，该版本阻断了野生型RAN蛋白与GTP结合的正常功能。此外，我们还在TFL1中使用的TFL1调控序列GUS(图1a)驱动下，生成了表达带有3flag标记的DN-ran2的TFL1: 3flag -DN-ran2转基因植株(扩展数据图8b)，以测试RAN蛋白对TFL1的原位效应。
值得注意的是，gDN-ran2-3FLAG和TFL1:3FLAG-DN-ran2转基因株系均与tfl1-20的主要种子大小参数相关，产生的种子比RAN1-3的单突变体和双突变体大得多(图4c和5a，扩展数据图5e和8c)。
c，野生型（WT），tfl1-20，gDN，TFL1：DN和tfl1-20 TFL1：DN植物的成熟干种子的比较。比例尺，500μm。
与tfl1-20一样，4个DAP的gDN-ran2-3FLAG和TFL1:3FLAG-DN-ran2也检测到种子腔扩大的表型(图5b,c)。
b，从3到5 DAP，WT，tfl1-20，gDN，TFL1：DN和tfl1-20 TFL1：DN的整粒种子的DIC显微镜检查。比例尺，100μm。 c，在3–5 DAP时，WT，tfl1-20，gDN，TFL1：DN和tfl1-20 TFL1：DN的种子腔面积的比较。在每个时间点检查随机选择的种子（WT种子分别在3–5 DAP时，n = 19、18和24； tfl1-20种子在3–5 DAP中，n = 14、13和20； gDN种子在3–5 DAP，n = 24、12和16； TFL1：DN种子在3–5 DAP，n = 25、11和19； tfl1-20 TFL1：DN种子在3–5 DAP，n = 16、12和19）。值是平均值±s.d。每天的WT平均值设置为100％。星号表示野生型植物与其他基因型之间的统计学差异（双尾t检验，P <0.01）。在3 DAP时，WT与tfl1-20，gDN，TFL1：DN和tfl1-20 TFL1：DN的P值分别为0.141、0.0937、0.916和0.503。在4 DAP时分别为4.12×10-3、1.57×10-4、1.27×10-4和7.07×10-4;在5 DAP时分别为9.33×10-13、7.27×10-9、8.16×10-10和7.05×10-8。
此外，与野生型种子相比，在4 DAP时，大多数gDN-ran2- 3FLAG和TFL1:3FLAG-DN-ran2种子并没有发生胚乳细胞化(扩展数据图8d,e)，
d，通过共聚焦显微镜比较在4 DAP下清除的WT，tfl1-20，gDN，TFL1：DN和tfl1-20 TFL1：DN的整粒种子的外围胚乳发育。通过戊二醛处理产生自发荧光（绿色荧光）信号。箭头指示胚乳细胞化过程中的新细胞壁。合并，合并绿色荧光和明场图像。比例尺，50μm。 a-d中的实验独立重复了3次，结果相似。
e，通过共聚焦显微镜检查，在4 DAP时WT，tfl1-20，gDN，TFL1：DN和tfl1-20 TFL1：DN中具有合胞体或细胞化的外围胚乳的种子百分比。检查了每种基因型从10个以上角果中随机选择的种子。
说明RANs的负作用也会影响胚乳细胞化，从而产生大的种子。值得注意的是，虽然gTFL1-3HA和gTFL1-GFP完全挽救了tfl1-20的种子大小表型(图1e)，但在tfl1-20 gtfl1 - 3flag - dn -ran2背景下，这种拯救完全消失，因为tfl1-20 gTFL1-GFP tfl1- 3flag - dn -ran2和tfl1-20 gTFL1-GFP tfl1- 3flag - dn -ran2仍能产生较大的种子。这些结果表明，TFL1在控制胚乳细胞化和种子大小方面的作用取决于RAN蛋白的活性。
为了研究RAN蛋白如何影响TFL1在种子发育中的作用，我们对ran2- gRAN2-3FLAG和gDN-ran2-3FLAG角状细胞进行了细胞分离分析，发现RAN2-3FLAG及其显性阴性的DN-ran2版本均定位于细胞质中(图5d,e)。
d–f，通过特定基因型在4 DAP上的长角果的细胞分级分析显示，RAN2（d），DN-ran2（e）和TFL1（f）的亚细胞定位。分别使用抗FLAG或抗HA抗体进行了蛋白质印迹分析，以检查这些片段的核（N）或胞质（C）组分中的RAN2，DN-ran2和TFL1蛋白。与细胞质分数相比，核分数过量十倍。用丽春红S染色的RbcL和使用抗组蛋白3（H3）的免疫印迹分析分别用作细胞溶质和核级分的指标。
无论TFL1- 20 gTFL1-3HA中是否存在野生型RAN2(图3f)，或TFL1- 20 gTFL1-3HA中是否存在显性阴性的DN-ran2(图5f)， TFL1- 3ha都只存在于细胞质中，这表明RAN蛋白不太可能影响TFL1的核浆转运。相比之下，tfl1-20 gTFL1-GFP TFL1:3FLAG-DN-ran2的共聚焦分析显示，TFL1-GFP在过渡阶段局限在合点胚乳的细胞质中(图5g和扩展数据图9c)
g，通过冷冻切片以4 DAP将tfl1-GFP定位在tfl1-20 gTFL1-GFP TFL1：DN种子中。 TFL1-GFP信号可在合点端（CZE；左两幅图）及其特写视图（右两幅图）中观察到。请注意，SPE中不存在TFL1-GFP。合并，合并GFP和明场图像。比例尺为40μm（左）和10μm（右）。
c，通过冷冻切片以4 DAP将TFL1-GFP定位在另一tfl1-20 gTFL1-GFP TFL1：DN种子中。 TFL1-GFP信号可在合点端（CZE；左图和中图）及其特写视图（右两图）中观察到。注意，所有合胞体周围胚乳（SPE）中都不存在TFL1-GFP。合并，合并GFP和明场图像。比例尺40μm（左）和10μm（右）
，而不局限在SPE中，如tfl1-20 gTFL1-GFP所示(图3d)。这表明显性阴性的DN-ran2抑制了TFL1从合点胚乳向SPE的转运。总的来说，这些观察结果表明RAN蛋白与合点胚乳中的TFL1相互作用，并决定其转运到SPE，从而影响种子发育过程中胚乳细胞化的及时进行。
TFL1与ABI5相互作用，影响ABI5在种子发育过程中的稳定性。为了进一步阐明TFL1是如何影响胚乳细胞化的，我们试图评估TFL1的功能是否与IKU通路中的调节因子相关。既往研究表明，ABI5直接抑制SHB1表达，通过SHB1- mini3 - IKU2途径影响胚乳细胞化。ABI5的功能丧失相应表现为大的种子表型(扩展数据图10a)。
扩展数据图10 |检查与ABI5有关的种子大小表型和基因表达。 a，tfl1-20，abi5-1和tfl1-20 abi5-1种子大小参数的定量分析。箱形图显示了不同基因型（WT，n = 198； tfl1）的种子大小参数（面积，周长，长度和宽度）的中位数（线），四分位间距（框）和晶须（扩展了四分位间距的1.5倍） -20，n ＝ 133； abi5，n ＝ 110； tfl1-20abi5，n ＝ 138）。显示了相对于野生型（WT）植物的平均值设置为100％的突变体种子参数的百分比变化（％）。每个框上方显示了突变体相对于WT的百分比增加。星号表示野生型植物和其他突变体之间的显着差异（两尾曼惠特尼检验，P <0.001）。 WT和abi5之间的种子面积，周长，长度和宽度的P值分别为1.48×10-12、1.74×10-8、1.55×10-11和1.78×10-4，而WT与abi5之间的P值tfl1-20或tfl1-20 abi5均小于1×10-15。
ABI5在所有检测的组织中广泛表达，包括2 - 7 DAP的长角果(扩展数据图10b)，
b，定量分析授粉后2至7天（DAP，下图）在各种组织（上图）或正在形成的角果中ABI5表达。 OF，开花； IS，花序茎； RL，莲座叶； Rt，根；sil，长角果； CL，茎生叶； FB，花蕾。将结果相对于作为内部对照的U-BOX基因的表达水平进行了标准化。下部面板中的表达水平显示为相对于设置为1的2 DAP水平的相对值。值是三个生物学重复的平均值±SD。
而ABI5- gus融合蛋白在4 DAP的过渡阶段在整个种子中表达(扩展数据图10c)。
c，在4DAP时，gABI5-GUS和tfl1-20gABI5-GUS种子之间的GUS染色信号的比较。通过在终止密码子TAA之前将GUS基因与4.1-kb ABI5基因组片段翻译融合产生了gABI5-GUS构建体。比例尺，50μm。该实验独立地重复了三遍，结果相似。
此外，有报道称FL1与FD蛋白相互作用，FD蛋白是一组碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)转录因子中ABI5的同源物(扩展数据图10d)。
d，A组基本亮氨酸拉链（bZIP）转录因子的系统发育分析。系统进化树是由MEGA4使用邻居加入算法生成的。分支上的数字表示1,000个重复中的引导程序值。 ABI5和FD用红点标记。
这些结果促使我们研究TFL1是否与ABI5相互作用调节种子大小。
下拉检测显示His-ABI5结合到vitro翻译的MBP- tfl1上，但不结合MBP本身(图6a)。
图6 | TFL1通过影响ABI5稳定性来部分调节种子大小。 a，TFL1和ABI5之间相互作用的体外下拉试验。 MBP和MBP-TFL1用作诱饵，并使用抗MBP抗体通过免疫印迹分析检查相应的上样对照（下图）。猎物蛋白His-ABI5的输入及其相应的下拉信号通过使用抗His抗体的免疫印迹分析进行检查（上图）。
检查TFL1之间的交互,在拟南芥ABI5中,我们生成gABI5 - 3FLAG转基因植物中4.1 kb ABI5基因组片段,包括2.3 kb 5上游序列,1.6 kb ABI5编码区转化融合3FLAG,和216 - bp 3下游序列,救出abi5-1的大型种子表型。gABI5-3FLAG tfl1-20 gTFL1-3HA与tfl1-20 gTFL1-3HA基因杂交产生的gABI5-3FLAG tfl1-20 gTFL1-3HA 长角果总蛋白提取物的CoIP分析显示，ABI5-3FLAG与TFL1-3HA在体内相互作用(图6b)，
b，CoIP显示的拟南芥中TFL1-3HA和ABI5-3FLAG之间的体内相互作用。用抗FLAG抗体免疫沉淀来自tfl1-20 gTFL1-3HA或gABI5-3FLAG tfl1-20 gTFL1-3HA的年轻长角果的总蛋白提取物。使用抗HA（上图）或抗FLAG（下图）抗体通过免疫印迹分析检查输入的和共免疫沉淀的蛋白质。
说明了ABI5-3FLAG与TFL1-3HA的相互作用。
值得注意的是，我们发现在4 DAP时，与野生型种子相比，tfl1-20角果中ABI5-3FLAG蛋白水平显著降低(图6c)，这与tfl1-20相对于野生型种子的ABI5-GUS信号较弱一致(扩展数据图10c)。
c，在野生型（WT）或tfl1-20背景下的gABI5-3FLAG中ABI5降解的体内测定。使用抗FLAG抗体通过免疫印迹分析检查了在4 DAP时从长角果中提取的总蛋白。每个泳道下方的数字表示相对于gABI5-3FLAG（WT）中设置为1.00的值的ABI5蛋白水平，均针对用Ponceau S染色的RbcL进行了标准化。星号表示非特异性条带
在植物细胞ABI5蛋白质通过26 s蛋白酶体途径退化,然后测试TFL1之间的交互和ABI5是否可能影响ABI5-3FLAG gABI5-3FLAG稳定和tfl1-20 gABI5-3FLAG长角果对待环己酰亚胺(一种蛋白质合成抑制剂)在没有或存在MG132 (26 s蛋白酶体抑制剂)。在野生型和tfl1-20背景下，环已酰亚胺和MG132联合处理3小时，均显著提高了ABI5-3FLAG的稳定性，且tfl1-20与野生型蝶骨相比，其ABI5-3FLAG水平下降的幅度明显小于单独处理环已酰亚胺(图6d)。
d，在MG132或环己酰亚胺（CHX）处理下，在野生型（WT）或tfl1-20背景下的gABI5-3FLAG中ABI5降解的体内测定。在50μMCHX加0.012％Silwet L-77的存在下，在不使用或使用50μMMG132的情况下，对4 DAP的长角果进行处理，并在指定的时间点进行收集。每个泳道下方的数字表示相对于gABI5-3FLAG（WT）中处理1小时（不使用MG132或使用MG132）的值设置为1.00的ABI5蛋白水平，所有这些均针对Ponceau S染色的RbcL进行了标准化。特定的乐队。 a-d中的实验独立重复了3次，结果相似。
这些观察结果表明，TFL1和ABI5的相互作用至少影响了26s蛋白酶体途径介导的ABI5的稳定性。
这些图我都看得不太懂，不会看图是阅读文献的硬伤，然而不会看图的主要原因是不知道文章所提到的分析方法，我要想个办法，把这些常用的分析方法学习一下，要不然一碰到这些文章就一知半解。
