浅谈RT-PCR、qRT-PCR原理

1、RT-PCR原理

RT-PCR即逆转录PCR，是将RNA的反转录(Reverse Transcription,RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。可用于检测细胞中基因表达水平。

RT-PCR过程

mRNA 3’端具有Poly(A)尾，Oligo(dT)与其配对，仅mRNA可被反转录，Oligo(dT)primer 对mRNA进行反转录。

核糖核酸酶H (RNase H)是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。

反转录酶(reverse transcriptase)是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。

2.qRT-PCR（精确定量precise quantitative）

qRT-PCR定义：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分析。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。

SYBR 染料法

SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，可以与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。

为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和Ct值。

荧光阈值（threshold）：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的偏差的10倍。

Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

threshold与Ct关系

Ct值与起始模板的关系：

       每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

计算起始拷贝数过程

还不够完善，后续学懂了再添加。