Best practices for the analytical validation of clinical whole-genome sequencing intended for the diagnosis of germline disease
摘要
全基因组测序（WGS）有望成为罕见遗传疾病患者的第一级诊断测试；然而，缺乏解决最佳测试的定义和部署实践的标准。为了解决这些差距，由美国和加拿大领先的医疗和研究组织组成的医疗基因组计划（Medical Genome Initiative）通过发布最佳实践来扩大高质量临床工作组的使用范围。在此，我们就临床WGS分析验证对疑似种系疾病患者的诊断提出了一致建议，重点是测试开发、测试设计的前期考虑、测试验证实践和监测测试性能的指标。这项工作还深入了解了各成员机构WGS测试的现状，包括各现场参考标准和其他标准的使用情况。重要的是，该倡议的成员坚信，临床WGS是一种适合于罕见遗传疾病患者的一级测试，至少可以取代染色体微阵列分析和全外显子组测序。本文提出的建议应减少实验室将WGS引入临床实践的负担，并支持安全有效的WGS检测用于种系疾病诊断。
介绍
在过去十年中，下一代测序（NGS）的进展通过提高诊断率和缩短诊断时间改变了基因检测。靶向NGS多基因panels已被广泛使用，全外显子组测序（WES）在诊断具有非特异性表型特征的患者和危重新生儿方面是一个有力的辅助手段，其中鉴别诊断通常包括多个罕见的遗传病。然而，这些方法同时具有工作流和测试内容的限制，这可能会限制它们的总体效能。
全基因组测序（WGS）可以解决其他基于富集的NGS方法的许多技术限制，包括提高覆盖率以及检测结构和复杂变异的灵敏度。WGS还可以识别非编码变体，如破坏调控区的致病性变体、非编码RNA和mRNA片段。WGS的新用途包括HLA基因分型、药物遗传学测试和多基因风险评分。几项研究已经证明WGS在广泛的人群中识别临床相关变异方面的优势，并且与常规检测相比，WGS在儿科患者和危重患儿中的诊断优势。作为一种更有效的检测方法，WGS有望取代靶向NGS或WES和染色体微阵列（CMA），作为一种一线实验室方法，用于评估疑似遗传性疾病的儿童和成人。WGS还具有跨多种变异类型定期再分析的优势，这将通过更新注释和分析技术提高诊断效率。尽管临床WGS的广泛采用已进入阶段，但技术挑战依然存在，解决最佳临床WGS测试的定义和部署实践的标准尚未完全定义。专业机构在为临床WGS测试验证提供指导方面取得了进展，并开始出现使用参考标准和推荐精度度量进行基准测试的最佳实践。然而，值得注意的是，这些建议并未解决与临床工作组设置相关的具体挑战。
范围和方法
为了应对这些挑战，成立了一个由医学基因组倡议专家组成的工作组，以制定与临床WGS分析验证相关的实用建议。我们决定将重点放在使用临床WGS测试诊断生殖系疾病上，并且WGS的其他应用（如检测体细胞变异或无细胞循环DNA）被认为超出了范围。由于实验室试验验证的许多基本原则也适用于WGS，因此本文件不打算对实验室试验验证的所有步骤进行全面描述，而是侧重于临床WGS验证带来的具体挑战。
为了确定小组共识的领域并最终为临床实验室制定实用建议，创建了一项调查，向工作组成员询问与分析验证相关的关键主题，包括他们自己当前的实验室实践。在12个月的时间内，每两周举行一次电话会议，分享和讨论这些现行做法，并确定在哪些方面可以达成共识。值得注意的是，由于验证方法的可变性和实验室间使用的广泛质量控制指标，往往难以达成共识。尽管如此，本文提供的这些建议旨在帮助希望将WGS引入临床实践的实验室人员，更重要的是，支持安全有效的WGS检测以诊断种系疾病。
临床全基因组测序综述
所有临床诊断测试，包括WGS，包括从获取患者标本到提交临床报告的整个过程。临床WGS的技术和分析要素可分为三个阶段：样品制备，包括提取和文库制备，然后是序列生成（初级）；读取对齐和变量检测（辅助）；注释、筛选、优先排序、变体分类和案例解释，然后是变体确认、分离分析和最终报告（第三级）（图1）。这些组件在所有高通量测序测试和信息学管道中都是通用的，但组件（如信息学算法）的差异将导致数据质量和准确性的差异。本手稿的重点是主要和次要分析，因为这些步骤与临床WGS分析验证的测试性能评估直接相关。以下三个部分描述了建立分析有效性的关键要素：（1）测试开发和优化，（2）测试验证，（3）临床使用中测试的持续质量管理。分析验证的主要步骤和活动如图2所示，关键定义见方Box 1。表1总结了这些章节中的要点和建议，以及未来的考虑事项。
图2 临床WGS试验分析验证的关键步骤。临床WGS分析验证的关键步骤包括测试开发优化、测试验证和质量管理。每一步都涉及到能带来既定结果的活动。
测试开发与优化
作为测试开发和优化的一部分，应考虑临床WGS测试设计的几个组成部分。在这里，我们集中讨论临床WGS的一些独特方面，包括测试的定义、与当前方法的测试性能比较以及测试设计的前期考虑。补充讨论中更详细地讨论了样本和文库准备、测序方法、序列分析和注释等其他组成部分。
图1 临床全基因组测序工作流程。临床WGS的工作流程涉及跨越湿实验室和信息学过程的三个主要分析步骤：初级（蓝色）分析是指通过将原始测序仪器信号转换为核苷酸和序列读取的过程，从生物样本中技术生成DNA序列数据；二级（绿色）分析是指通过读比对和变体调用识别DNA变体；三级（黄色）分析是指变量注释、过滤和优先级划分、分类、解释和报告。可以挖掘健康记录信息和表型，并将其转换为人类表型本体（HPO）术语，以帮助解释变异。主要分析包括样品、文库制备和测序，然后进行广泛的质量控制（QC）。在这一阶段，采用正交法（SNP阵列或靶向分析）进行基因分型，以达到质控目的。辅助分析包括映射、读取对齐和变量调用。不同种类的变异（SNV、SV、CNV、线粒体和重复扩增）将使用可以并行运行的不同算法。除了校准和变量调用的质量控制外，还可以使用正交基因分型来确保在整个工作流程中没有出现样本混淆。三级分析从变异注释开始，然后根据表型和临床试验指征进行筛选、排序和变异分类。根据ACMG指南对变异进行分类可能是自动化的，但最终的解释涉及人类干预，最终将由病例表型决定。根据与试验主要指征的相关性和与试验原因无关的次要或偶然发现，报告变异，采用任何必要的确认方法。可采用正交湿实验室法或基于试验验证方式的数据电子检查进行确认。临床相关性（粉红色）由主治医师执行，可能涉及反复反馈和与实验室合作（虚线箭头）。在整个过程中，收集聚合数据对于生成内部等位基因频率和与存储库共享解释数据是必要的。
测试定义注意事项
分析验证要求将根据试验定义而变化，试验定义包括技术考虑因素和患者群体的预期用途。虽然临床WGS可用于多种适应症（例如，遗传性疾病、癌症和健康个体），但本文档重点介绍了将临床WGS用于疑似单基因种系疾病的个体作为主要使用案例。然而，此处描述的分析有效性原则适用于临床WGS的所有用途。
由于测试的复杂性，为临床WGS建立测试定义以诊断生殖系疾病对实验室来说可能是一个挑战。临床WGS测试基于一个特定的测试定义，该定义描述了待报告的变异类型和将被询问的基因组区域（包括任何限制），这可能因变异类型而异。由于WGS变异检测的综合性，挑战在于测试定义是否应与表型无关，并基于针对特定表型检测或定义的变异类别，因为特定位点可以被询问和报告。目前基因组测序最有效的用途是评估具有广泛潜在遗传病因的临床表现。然而，由于可以通过临床WGS查询特定位点和相关变异类型（例如，SMA的SMN1缺失或脆性X染色体的FMR1扩增），测试定义的范围将扩大，并随着分析性能的提高而发展。
表2总结了临床WGS可检测到的临床相关遗传变异类别，包括单核苷酸变异（SNV）、小缺失、重复、插入（INDEL）、结构变异（SV），包括拷贝数变异（CNV）和平衡重排、线粒体（MT）变异和重复扩增（REs）其中一些变体类别的检测准确度已得到充分证实，而其他类别在技术上是可行的，但证明足够检测准确度的数据仍在不断涌现。临床WGS测试应尽可能分析和报告所有可能检测到的变异类型。我们推荐SNVs、indels和CNVs作为WGS测试中可行的最合适的一组变体。实验室应进一步致力于提供MT变体、REs、一些结构变体和选定的临床相关基因的报告，这些基因的分析评估因假基因或高度同源序列而变得困难（表1和补充图1）。我们注意到，实验室可能无法在临床WGS首次启动之前验证所有类别的变异，并且可能需要分阶段进行验证和后续测试。最终，实验室必须提供明确的测试定义，并确定影响可报告变异类型的因素，以供订购医生使用。例如，如果使用预期产生有限DNA量的样本源，可能需要PCR进行文库制备，CNVS和RES的报告将受到不利影响。
测试性能注意事项
无论实验室可能选择报告哪种变体类型，WGS测试和任何当前测试方法之间的彻底性能比较都是有保证的，以证明分析性能足以用于临床。临床WGS测试性能应旨在达到或超过其所替代的任何测试。如果临床WGS的部署与当前参考标准测试相比存在任何既定的性能差距，则应在测试报告中注明（见表1）。临床WGS最直接和最明显的用途是替代全基因组测试，如WES和CMA。在检测影响蛋白质功能的变异方面，WGS在分析上优于WES，并且有新的证据表明，WGS对CNV的分析检测至少相当于CMA（补充表1）。
对于某些变异类型的检测，重要的是要认识到临床WGS可能不等同于当前的方法，稳健的检测尚未建立。例如，与WES或靶板相比，低水平镶嵌的检测代表了临床WGS（40×平均深度）的一个重要限制，其中性能的丧失可能是某些适应症（例如癫痫性脑病）46的一个重要问题。如前所述，尽管可以使用WGS识别上述更复杂的变异类型（例如，异质性水平不同的MT变异、REs等），但我们认识到，在某些情况下，这些变异类型的检测精度可能还不等同于目前接受的分析。在临床WGS的测试定义中包含这些变异类别仍然具有内在价值，以确保尽可能完整的测试，只要测试敏感性的限制得到明确定义。与任何基因检测一样，检测定义应明确指出，在这些情况下，阴性报告并不排除诊断。计划报告复杂变体类型的实验室必须在报告中包括测试限制，并制定详细的验证性测试策略。这项倡议的共识是，在报告之前，有必要使用正交法对这些变异类型进行验证性测试（表1）。
测试设计的前期考虑
WGS测试设计的前期考虑因素，如样本和库制备、测序方法、序列分析和注释通常遵循当前指南，并在补充讨论中讨论。以下讨论了针对临床WGS的更复杂的测试设计考虑因素，例如评估指标以确定合适的WGS测试覆盖率，以及验证所需的样本数量和类型。
评估基因组覆盖率、完整性和可调用性
定义和评估高质量的基因组覆盖率是临床WGS测试开发中最重要的考虑因素之一，因为它直接关系到准确识别感兴趣的变体所需的数据量。衡量基因组完整性的指标应用于定义临床工作组的绩效，并包括覆盖的总体深度和均匀性。与正交调查的真值集相比，应针对基因组的可调用区域和每种变异类型的相关调用准确度对这些测量进行监测（表1）。虽然尚未确定通用截止值，但建议结合覆盖深度、基本质量和映射质量来评估可调用性48。该计划中的大多数实验室计算原始和可用覆盖率，后者与变体检测中使用的读取相关，不包括映射不良的读取、低质量的碱基对和重叠的成对读取。所有站点都使用不同的平均覆盖深度评估了临床WGS的性能，并评估了特定目标文件（如参考标准）中变量调用的完整性和准确性，或与临床WGS替代方法的比较（例如WES；补充图2、3）。评估方法的可变性可能导致指标和截止值的差异（表3）；
然而，当使用参考标准对该计划中三个地点的基因组完整性进行评估时，其值在97.1 - 98.1%之间，表明不同实验室的基因组测序具有一定的一致性(补充表2)。如果实验室提供来自不同DNA来源的WGS，这些评估应该对每种样本类型完成。
参考标准物质和阳性对照
高质量的参考标准物质和阳性对照以及相关的真实数据集是提供临床WGS的实验室的必要资源。临床WGS的分析验证应包括公开的参考标准品，以及每种变异类型的商用和实验室阳性对照品。对于通常由该字段处理的变量类型，包括snv和indels，如果这些包含公认的参考标准，则可以使用最少数量的控件。对于标准仍在发展的变体类型（如REs），应使用更多的样本（表1）。国家标准与技术研究所（NIST）NA12878基因组和Platinum基因组通常由NGS实验室使用，以建立WGS分析有效性。这些基因组得益于数千种变体，这些变体已在许多技术中得到策划和确认。在这项倡议中，所有团体都使用NA12878进行验证，大多数团体还利用个人基因组计划中的德系犹太人和中国人祖先三人组作为参考材料，使用变异基准（补充表3）。
通过变种类型细分分析性能的能力是使用特征良好的参考材料的另一个好处。全基因组的敏感性估计通常掩盖了在某些序列上下文或跨不同的变异属性的不良表现。例如，在高同源性区域的大indel检测(>10 bp)的灵敏度将低于在不太复杂区域的小indel检测。理解基因组困难区域的表现对于准确地表示分析的局限性，并为开发新的分析工具和方法设定基准是很重要的。全球基因组和健康联盟(GA4GH)基准团队最近开发了工具(https://github.com/ga4gh/benchmarking-tools)来评估这种方式的绩效。目前，该项目的所有成员都已在其分析验证研究中纳入或打算使用此类分析的结果。
然而，仅参考标准材料不足以确定试验的有效性。例如，在为验证研究寻找样本时，还必须同时考虑标本和疾病背景。对于该联盟中的临床WGS实验室，标本背景包括可接受的样本类型(如血液、唾液和组织)的测定，以及相关的代表性阳性对照。一些致病变异，包括短串联重复，低拷贝重复，在非唯一序列中带有断点的sv，平行和假基因，发生在基因组难以测序，对齐和绘制的区域。如果计划对这些位点进行分析和报告，实验室应对具有这些特定变异类型的样本进行验证评估，以确定其稳健性。由于这些变量的性能预期可能没有很好地建立起来，因此应该使用大量的阳性对照(见下面和补充表3)。
测试验证
临床WGS需要多层面的分析验证方法，因为有大量的罕见遗传疾病位点，可以检测到的变异数量和不同类别，以及变异调用准确性的基因组上下文驱动的可变性。在整个分析过程中定义性能指标的传统汇总统计是必要的，但还不够。分析验证框架应包括考虑基因组复杂性的指标，特别注意序列内容和变异类型(表1)。例如，序列级别和拷贝数变体具有不同的调用约束，这些调用约束可能会受到低复杂度序列的不同影响。针对这些和其他临床WGS特异性验证要求的特定测试验证建议将在下面详细讨论。其他并非临床WGS独有的考虑因素包括测序偏置、重复性和再现性、检测限制、干扰和同源区域，以及疾病特异性变异验证(如SMA检测)、软件验证和测试修改和更新在补充讨论中进行了讨论。
性能阈值应预先确定，并与临床要求相匹配，以降低诊断错误率。可变呼叫阶段性能阈值的灵活性是可以接受的，只要将这些偏差记录在案，并且实验室程序包括额外的确认性评估。这些可能包括额外的生物信息学分析、分析人员的人工检查和正交实验室测试。在临床WGS试验中要检查的数据量需要将验证方法限制在具有潜在高临床影响的数据的小子集中。在验证变量调用时，不应该在灵敏度、精度或TPPV的计算中使用调用和无效调用。相反，作为检测准确性的一部分，这些应该单独记录，如果可能，通常具有低图谱质量和覆盖率的基因组间隔应该在临床WGS检测定义中标记。
识别不同的变体类型需要独特的调用算法，从而导致分析性能的差异。为了更好地了解总体测试性能，一些常见的变量类型需要根据大小进一步分层。例如，GA4GH建议将插入、删除和重复分装到<50、50 - 200和> 200bp大小的容器中(参考文献51)，但需要注意的是，该计划中的大多数实验室会评估额外的较小的容器(补充图4)。最小截止点与当前临床CMA的最大分辨率相似，根据所使用的平台不同，最大分辨率从20 kb到100 kb不等。该项目中的实验室目前使用基于深度的CNV调用者在CMA分辨率下提供CNV作为测试报告事件的一部分，而较小的CNV事件通常需要分裂或异常读取对信息，并配合深度评估。
变量调用的性能可能会受到区域本身的序列上下文的影响，或者，在大型变量的情况下，会受到周围基的影响。目前，还没有识别系统性问题区域或全面的人口水平真相数据集的最佳实践，但该倡议的所有成员都开发了识别此类区域的内部方法。这些包括临床WGS可能表现不佳的区域，包括非同源基因，它们被排除在测试定义之外，以指导适当的临床排序。该倡议还建议，被确定为系统问题的区域，或对与特定变异类型相关的变异呼叫产生负面影响的区域，作为测试验证的一部分，并在要求时提供给订购临床医生。已经存在一些同源性高的基因注释资源，可以作为一个起点(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK535152/)。在验证期间观察到的影响变体调用性能的限制应在报告中明确说明，并应包括对变体类型、大小和基因组上下文的引用(表1)。
确认样品的数量和类型
临床WGS验证所需的样本和标本类型的数量与实验室打算报告的检测定义和变异类型或已知疾病位点有关。在全基因组范围内验证所有可能的致病变异在技术上或实践上都是不可行的。因此，我们建议验证所需的样本数量由变异类型或被询问的目标位点来指导。对于小变异体(SNVs和indels)，该计划的成员一致认为，可重复和准确的基因组参考标准评估足以建立全球准确性，但这应该由包含一系列临床相关变异体的患者阳性对照加以补充。有趣的是，该联盟中实验室对小变异使用的阳性对照数量在10到85个之间(补充表3)，反映了实验室之间广泛的做法。
除小变异外，对变异类型的验证需要更多的阳性对照，并应包括最常受影响的基因、位点或针对特定位点的致病性变异。应评估的特定变异的数量可能根据变异类型、基因组环境和适当参考样本的可用性而有所不同。在可能的情况下，建议采用与Jennings等人概述的相似的统计上严格的方法，该方法包含了检测的置信水平和检测所需的概率。当应用这种方法并要求95%的可靠性和95%的置信区间时，在性能评估中至少应该使用59个变量，如之前发表的。以CNV验证为例，该项目成员使用了7至42例阳性对照(补充表3)，包括常见的微缺失和重复综合征(补充表1)。需要更多的阳性和阴性对照来评估准确性。随着测试范围的不断扩大，我们期望根据该项目和社区中其他项目的经验，就验证所需的控制数量的建议达成共识。
质量管理
与任何实验室检测一样，执行临床WGS的小组应该有一个健全的质量管理程序，以进行质量控制和质量保证，遵循来自CLIA (www.cdc.gov/clia)、CAP (https://www.cap.org/)和ISO (www.iso.org)的适用监管指导。这些监管机构的许多指导广泛适用于任何实验室检测，包括临床WGS，这里不讨论。相反，我们涉及了临床WGS检测质量管理的几点考虑，重点是控制样本、样本识别、库准备、测序质量和性能指标以及生物信息学质量保证。在表3中可以找到排序和性能指标示例的列表(其中许多示例将在下面的章节中讨论)。此表对每个指标进行了简要描述，以及被认为通过/失败的指标和那些应该被监控的指标的建议截止点或范围。
控制样品
提供临床WGS的实验室面临的最大挑战之一是应用controls来遵守监管指南。指南建议使用阳性、阴性和敏感性对照(例如，CAP分子病理学检查表，2018年8月- MOL.34229对照定性检测)，以确保检测的所有步骤都在没有污染的情况下成功执行。临床全基因组检测的持续质量控制应包括确定一套全面的性能指标，在一段时间内对这些指标进行持续监测，并根据总体样本量定期使用阳性对照(表1)。虽然在每一次测序中纳入对照参考标准是理想的，但对于进行临床WGS的实验室来说，这是不切实际的，在经济上也是不可行的。此外，阳性和阴性对照的使用可能对测序运行的总体性能提供信息，但不能反映特定样本的差异，并可能错误地表明足够的测试性能。
一些实验室可能会选择采用额外的阳性和阴性控制策略。该计划中的一些小组使用了PhiX，它代表了测序错误率的经验测量。对于变异阳性对照，一种方法是使用具有良好特征的阳性对照样本的低水平尖峰蛋白，在每次测序运行中包括变异谱。类似地，项目中的一些小组正在探索合成插入结构的使用，包括Sequins，它可以添加到低级别运行中(<1%的读取)，并支持至少可以作为某些变体类型的过程控制的性能评估。在这个计划中，大多数小组定期运行一个参考标准，并检查预期调用准确性的偏差以及与先前运行的样本的一致性。
Sample鉴定
考虑到产生最终结果需要多个步骤，建议在试管和仪器转移期间在实验室内进行样本识别跟踪程序，以确认最终结果的完整性。实施这一跟踪程序将减少在分析步骤中出现样品混淆的风险，但不一定会发现其他分析前的问题，如标签或样品收集错误。即使最初成员没有标准的方法应用，样品跟踪的例子包括WGS比较数据与多路检测snp基因分型或定制芯片,STR标记分析,或上升的方法。无论采用何种样本跟踪方法，WGS基因型与正交试验数据不一致，均导致试验失败(表3)。当对病例-父母三人组进行测序时，或在临床测试策略中包括其他家庭成员时，应使用类似上述方法。为了确定亲子关系和评估其他家庭成员之间的亲缘关系，应使用标准方法对孟德尔错误进行正式检查。
文库准备
DNA的产率和质量(例如，荧光测定法和大小范围)应该有明确的验收标准，允许DNA样本进入文库制备和测序。对于临床WGS，大多数实验室采用样本汇集和分子条形码技术。一些平台受益于双条形码策略(即库分子两端各有一个条形码)，以减少在flowcell55上跳码的可能性。必须建立具有验收阈值的质量度量标准(例如，库集中)，并且必须记录来自每个样本的结果。对于样品和样品库的制备，需要有程序来检测和解释质量的系统性下降和/或满足最低质量要求的样品百分比。样品库制剂控制可用于监测质量，并解决制剂与样品问题，非模板控制可用于监测系统污染。
测序质量和性能指标
作为质量控制的一部分，临床WGS的试运行质量指标和性能阈值应在样品水平上进行评估。质量保证程序应定期监测质量指标，并确定与试剂质量、设备性能和技术人员相关的测试性能趋势。
临床WGS样本水平质量指标描述生物样本和端到端检测在技术上是否足够(即该检测是否为所有变异类型(SNVs、indels、CNVs、CNVs)提供预期分析敏感性和技术阳性预测值)。和sv))在测试验证期间建立的基因组的可报告范围内。
在仪器的每次运行以及校准和变体调用之后计算质量指标(参见补充讨论以了解扩展描述)。测试开发优化和验证过程确定了对每个样品进行审查的指标，但对实验室来说，确定适当的阈值是一个挑战。表3列出了该联盟成员用于评估WGS通过/失败和监控的测序质量和性能指标的示例。
通过样本的重要指标包括每个样本产生共10亿碱基(Gb;>Q30)，过滤后的碱基比对率(PF读取对齐%)，预测基因组可用覆盖范围(意思是常染色体覆盖),重复的reads比例(% duplication),%callability(位置与基因型传递调用),任何样品污染的证据(%污染)。对于临床WGS，监测全球定位指标和评估临床重要位点的完整性(例如，OMIM基因和ClinVar致病变异)尤为重要。
平均覆盖率和覆盖率的完整性是常用的度量，但是正如前面所讨论的，这些可能在不同的组之间以不同的方式计算(参见前面关于覆盖率评估的部分)。值得注意的是，在发表的时候，该倡议未能就应该使用哪些指标以及需要满足哪些相应的门槛达成高度共识，无法成为合格的临床WGS测试。对于重要的措施的类型有一般的一致意见(表3)，但是这些通常是以不同的方式计算的，这使得达成一致意见很困难。这可能反映了不断发展的技术，以及每个小组在缺乏可接受的指导方针的情况下验证测试的方式。需要更多的数据和实验室经验，才能就定义临床WGS检测的性能指标阈值达成共识。
生物信息学的质量保证
为分析临床WGS试验而开发的临床生物信息学管道是复杂的，需要一个强大的质量保证程序来持续监测指标和管道更新。由于软件版本(例如，读取校准器和变体调用器)和注释数据源(例如，OMIM、Clinvar等)的不断更新，开发、验证和部署周期对实验室来说可能是一个挑战。管道版本在更新时需要重新验证(参见补充讨论“软件验证”)，并且必须使用带有参数和实现日期的系统来跟踪版本。所有代码更改都需要与数据源的版本一起文档化。管道可以用参考标准进行测试，以确保它们是可重复的和完整的，没有错误。
Summary
临床WGS有望成为诊断那些疑似遗传疾病患者的第一梯队测试。虽然一些指南已经开始出现，为基因组检测的分析验证提供建议，但与临床WGS的设置和部署相关的具体的c和l还没有解决。在本文中，我们的目标是基于医疗基因组计划成员的经验，通过对临床WGS分析验证的共识建议来解决这些差距。我们专注于为临床WGS部署提供测试开发优化、验证实践和持续质量管理方面的实用建议。即使在倡议的成员之间，也很难就具体建议达成共识，因为通常有不同但同样有效的方法来验证WGS的分析。缺乏共识的另一个原因是该领域的快速发展;WGS的流程不断更新和改进，意味着实验室往往处于不同的实施阶段。然而，该倡议的成员一致同意认可临床WGS作为罕见疾病患者可行的一级检测，并认为它应该取代CMA和WES。
这里提供的建议代表了该领域当前状态的一个快照，我们希望最佳实践继续发展。虽然在具体验证相关的实践上达成共识并非总是可能的，但所有小组都有一个共同的观点，即在临床WGS中建立标准是困难的，但却是至关重要的。研究和医疗机构内部及之间的合作努力和沟通对于建立指南和标准至关重要，以增加获得高质量临床WGS的机会，同时最大限度地降低患者风险。很明显，需要在社区中进行大量工作，以围绕定义有效临床基因组检测的分析原则建立明确的共识。
为此，我们的团队致力于从分析有效性的上游和下游为临床WGS主题提供最佳实践，包括基因组解释、数据基础设施和临床效用测量。