酵母双杂交服务专题（二）

        在理解了蛋白互作关系基础之上，为了解析它们的互作机制，往往还需要对其上下游通路上的基因进行分析。蛋白质之间的相互作用通过促进或抑制下游基因的转录，从而影响细胞的一系列生命过程。酵母单杂交技术是一种研究蛋白和DNA相互作用的常用手段，在上下游通路的研究中起着重要的作用，既可以用于验证明确的上下游关系，也可以用于筛选未知的上游基因。当筛选的是互作蛋白时，选择双杂筛库，当筛选的是上游基因时，选择单杂筛库。

酵母单杂交

        当我们需要筛选上游通路的相关基因时，选择的实验是酵母单杂交筛库。

酵母单杂交技术的原理：

         酵母单杂交技术（Y1H），起源于1993年的酵母双杂交技术，基于转录因子的作用原理。转录因子通常包含两个关键部分：一个是DNA结合结构域（BD），负责与特定DNA序列结合；另一个是转录激活结构域（AD），负责激活转录过程。在Y1H系统中，酵母的GAL4蛋白是一个标准的转录因子示例，其DNA结合区域富含锌指结构，能够激活上游激活位点（UAS），而其AD部分则能增强RNA聚合酶的活性。

       Y1H分析涉及两类载体：一类载体融合了目标DNA（诱饵Bait）和易于检测的报告基因；另一类则融合了目标转录因子（猎物Prey）和酵母的AD。这些载体被引入到适宜的酵母菌株中，当转录因子在酵母细胞核内与DNA结合时，AD部分将触发报告基因的表达。Y1H系统的一个关键特点是，无论转录因子是激活型还是抑制型，酵母的AD都能激活报告基因，因此此技术主要用于研究蛋白质与DNA的交互作用。

      说明:酵母单杂交技术是以特定的DNA序列作为诱饵来筛选能够与之相互作用的转录因子。相反，如果研究目标是识别特定转录因子所结合的DNA序列，那么通常采用的技术是ChIP-测序（ChIP-seq）。

图1 酵母单杂交原理

酵母双杂交

        酵母双杂交系统，最初由Fields及其同事在分析酵母中的GAL4转录因子时发明，已经逐步优化并演变成一种成熟的技术，主要用于研究蛋白质之间的相互作用。这项技术广泛用于筛选相互作用的蛋白质、确认和验证蛋白质之间的互作关系、探索蛋白质相互作用的机制，以及绘制蛋白质相互作用网络。

酵母双杂交技术的原理：

       酵母双杂交系统的构建基于对真核生物基因转录调控的理解。在这个系统中，反式激活因子如GAL4扮演关键角色，它由两个独立但功能上必不可少的结构域组成：一个是位于N端的DNA结合域（DNA-BD），另一个是位于C端的转录激活域（AD）。DNA-BD专门识别并结合到GAL4响应基因上游的激活序列（UAS），而AD则通过与转录机制中其他成分的相互作用来激活UAS下游的基因转录。DNA-BD和AD的单独存在并不能触发转录，但当它们空间上足够接近时，就能显示出完整的GAL4转录因子活性，从而激活下游基因的转录。

       在酵母双杂交系统中，“诱饵”（bait）蛋白X被构建到DNA-BD载体中，形成DNA-BD/X融合蛋白；“猎物”（prey）蛋白（即待测蛋白Y）被构建到AD载体中，形成AD/Y融合蛋白。若诱饵和猎物蛋白之间无相互作用，BD和AD无法结合激活序列，因此报告基因不会被激活和表达。相反，如果在酵母中诱饵和猎物蛋白相互作用并表达，则BD和AD会与激活序列结合，激活下游报告基因（如抗性筛选、蓝白斑筛选、营养缺陷型筛选等）的表达。

        因此，可以通过观察报告基因是否被激活来判断bait和prey蛋白是否发生了相互作用。

图2 酵母双杂交原理

         卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/) 可提供优异的酵母单/双杂交文库构建、酵母单/双杂交验证服务。我们的酵母杂交系统是由基于SMART法构建的文库、酵母菌株、严谨的报告基因、高表达载体组成的。这项技术可用于：研究蛋白的相互作用；确认蛋白的交互作用；定义蛋白的交互域。

案例

酵母双杂交：

        在自然界中，花粉孔的调节由特定因子控制。遗传学筛选揭示了INP2作为花粉孔形成的关键调控因子。使用激光共聚焦显微镜观察显示，INP2的突变体在表型上与INP1突变体极为相似。此外，INP2和INP1在蛋白结构、表达模式以及遗传互作方面也表现出了相似性，由此推断INP1和INP2可能存在功能上的相互作用，进而利用酵母双杂交实验来验证这一假设。

      最初的酵母双杂交实验使用INP1和INP2的全长蛋白，结果显示这些酵母菌无法在缺失某些营养的培养基上生长，表明了一个初步的阴性结果。深入分析INP2的序列后发现，它含有一个跨膜域，这可能使INP2定位在细胞膜上，导致无法有效激活酵母内的报告系统。移除这个跨膜域后，酵母双杂交实验成功地证实了INP1和INP2之间的相互作用。

      此外，研究还发现这种蛋白互作具有物种特异性。例如，当使用番茄中的INP1和INP2进行酵母双杂交实验时，只有番茄的INP1和INP2之间发生了相互作用，而拟南芥的INP2则无法与番茄的INP1发生互作，这进一步证实了INP1和INP2之间的特异性互作关系。

Fig.3 INP1 and INP2 physically interact.(A) Yeast two-hybrid assay of interaction between INP1 and INP2ΔN (lacking the N-terminal region). BD,DNA-binding domain; AD, activating domain; SD, synthetic defined medium. To test for the presence of both BD and AD constructs, leucine (L) and tryptophan (W) were excluded from the medium. To test for protein interaction, yeast were grown on media lacking L, W and histidine (H) and containing 20 mM 3-aminotriazole (3-AT).(B) INP1 and INP2 interact in a species-specific manner. a, Y2H assay testing SlINP1 interactions with SlINP2 (or SlINP2ΔN lacking the N-terminal region) and AtINP2ΔN. To test for the presence of both BD and AD constructs, leucine (L) and tryptophan (W) were excluded from the medium. To test for protein interaction, yeast were grown on media lacking L, W and histidine (H) and containing 3 mM 3-aminotriazole (3-AT)【A species-specific functional module controls formation of pollen apertures.DOI：10.1038/s41477-021-00951-9】

注：

INP1 and INP2 from tomato Solanum lycopersicum (SlINP1 and SlINP2)

INP2 from Arabidopsis（AltNP2）

AltNP2 without its TM domain（AltNP2ΔN）

INP2 without its TM domain (INP2ΔN)

酵母单杂交：

        该研究揭示了在柽柳中，盐诱导的ThHSFA1与ThWRKY4转录反应在耐盐性及其调节机制中扮演关键角色。在盐胁迫和脱落酸（ABA）处理下，ThHSFA1和ThWRKY4在根部和叶片中的表达显著增强。ThHSFA1是一种位于细胞核的蛋白质，具有转录激活功能。它作为一个上游调控因子，能直接与ThWRKY4基因启动子上的热激应答元件（HSE）结合，进而促进ThWRKY4基因的表达。

  为了验证这一发现，研究团队扩增了含有顺式作用HSE的ThWRKY4启动子区域，并将其克隆到pHIS2载体中。同时，ThHSFA1的完整cDNA也被克隆到pGADT7-Rec2载体中。这些带有ThHASF1和ThWRKY4启动子片段的阳性转化体能够在含有3-AT的TDO培养基中良好生长。这些实验结果进一步证实了ThHSFA1蛋白与ThWRKY4启动子中的HSE发生结合，从而调控ThWRKY4基因的表达。

Fig 4. Identification of the upstream regulator ThHSFA1 of ThWRKY4. (A) Y1H assay.(B) ChIP assay.(C) Dual-luciferase reporter assay.【ThHSFA1 Confers Salt Stress Tolerance through Modulation of Reactive Oxygen Species Scavenging by Directly Regulating ThWRKY4.DOI：10.3390/ijms22095048】

酵母单杂交：

      为了解析CstMYB1和CstMYB1R2的作用机制，已经证明两个MYB基因，它们调节类胡萝卜素的代谢。通过酵母单杂交（Y1H）的方法检测出了它们与类胡萝卜素途径基因PSY和CCD2启动子的相互作用。

       首先，作者扩增并克隆了PSY和CCD2的启动子，并进一步扩增了100bp PSY和170bp CCD2启动子的天然片段。这些片段分别含有一个和两个MYB结合区域。另外，作者也相应地生成了它们的突变体结构（PSY一个，CCD2两个）。分别用天然和突变的启动子片段制备诱饵菌株，并通过检测每个诱饵菌株的最小aureobasidin A（AbA）浓度，推断它们与CstMYB1和Cst-MYB1R2的相互作用。对于PSY启动子，只有CstMYB1R2表现出相互作用，当突变型PSY诱饵株（pPSY-mut）的PSY启动子区段的MYB结合位点发生突变时，这种相互作用就会消失，这一结果表明了CstMYB1R2-PSY相互作用的特异性（图A）。

       同时，作者还观察到CstMYB1、CstMYB1R2共转化 CCD2天然片段诱饵（pCCD2wt）的酵母细胞可以在添加了AbA的选择性培养基上生长，这证实了CstMYB1和CstMYB1R2与CCD2启动子的相互作用。然而，只有一个MYB结合位点发生突变的CCD2菌株（pCCD2mut1）可以在含有200 ng mL-1 AbA的选择培养基上生长，而两个MYB结合位点都发生突变的CCD2菌株（pCCD2mut2）无法在选择培养基上生长（图2B）。因此，CstMYB1仅与CCD2启动子直接结合，而CstMYB1R2同时与PSY和CCD2启动子结合。

Fig. 1 Yeast one hybrid assay showing binding of CstMYB1 and CstMYB1R2 with promoters of (A) PSY and its mutant forms (B) CCD2 and its mutant forms. The transformants were grown on SD-Ura-Leu supplemented with 200 ng of aureobasidin(Bhat et al., 2021)【Crocus transcription factors CstMYB1 and CstMYB1R2 modulate apocarotenoid metabolism by regulating carotenogenic genes.DOI：10.1007/s11103-021-01180-6】

       酵母单杂交实验显示CstMYB1和CstMYB1R2与启动子（A） PSY及其突变形式（B） CCD2及其突变形式的结合。转化子在SD-Ura-Leu上生长，并添加200 ng的AbA(Bhat et al., 2021)。

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