A functional taxonomy of tumor suppression in oncogenic KRAS-driven lung cancer
cancer discovery 29.497
思路
从TCGA、GENIE和TRACERx数据库中选取突变频率高的以及文献调研多个方面评估所得的48个抑癌基因→构建慢病毒载体池→tuba-seq测序测得每种KO掉的基因的肿瘤细胞数量、大小等等→评估抑癌基因对于肿瘤大小、生长速度的影响等等
ABSTRACT
genome sequencing
combination of somatic CRISPR-based genome editing with tumor barcoding and high-82throughput barcode sequencing (Tuba-seq)
integrate multiple critical advances in our Tuba-seq pipeline
结果
1、候选抑癌基因的优先排序
①为了描述肿瘤抑制的功能状况，我们选择了48个已知和假定的肿瘤抑制基因，在致癌的KRAS驱动的肺癌模型中使用Tuba-seq进行研究（图1A；方法）。
②这些基因是基于多种标准选择的，包括它们在TCGA、GENIE（需要申请）和TRACERx数据集中的肺腺癌中的突变频率，它们在泛癌基因组数据中的突变频率，以及它们的突变谱与肿瘤抑制活性的一致性（图1A和B；补充图S1A-E和表S1）（2,4-7）。
③我们还考虑了它们在其他癌症类型中的假定肿瘤抑制功能以及它们的分子功能（补充图S2A和B）（8,29,30）。我们的候选基因在其突变频率和与致癌KRAS改变的共现率上有很大差异（补充图S1C-E）。
④重要的是，这些基因包括研究得很好的肿瘤抑制因子以及支持其在抑制癌变的任何方面的作用的证据非常有限的基因（补充图S3A和B）。
2、定量分析发现了多种抑癌剂，它们具有明显的抑制肿瘤生长的能力
①为了确定灭活每个候选抑癌基因对体内肿瘤发生的影响，我们使用Tuba-seq来量化每个基因失活后的肿瘤大小分布（补充图S4A）
②我们构建了至少两个Lenti-sgRNA/Cre载体，其中不同的sgRNA靶向每个基因，和5个Lenti-sginanter/Cre阴性对照载体（共102个载体；图1C；补充表S2）
③每个载体包含两个组分sgID-BC，其中sgID唯一地识别sgRNA和不同随机20核苷酸条形码（BC）唯一地标记每个克隆肿瘤。我们分别生成每个慢病毒载体，并将它们集合起来生成高度复用的向量池（slot-sgTS102/Cre；图1C；方法）。
④我们在KrasLSL-G12D/+；R26LSL-Tom；H11LSL-Cas9（KT；H11LSL-Cas9）小鼠和Cas9阴性对照KrasLSL-G12D/+；R26LSL-Tom（KT）小鼠中用该池引发肺肿瘤。这些Cas9阴性小鼠需要确认所有载体在没有Cas9的情况下对肿瘤生长几乎没有影响，并计算基因型特异性对肿瘤数量的影响（见下文）。15周后，KT；H11LSL-Cas9小鼠的肿瘤明显大于KT小鼠（图1D）。
⑤我们从大量携带肿瘤的肺中提取DNA，并使用Tuba-seq来量化每只小鼠的总体肿瘤负荷和每种基因型的每种肿瘤的大小。
⑥KT；H11LSL-Cas9小鼠的肿瘤细胞总数增加约10倍，总肺重量也相应增加（图1E）。对每个sgRNA对肿瘤生长的影响的初步分析（同一sgRNA的所有肿瘤中肿瘤细胞的相对数量的度量）强调了许多基因作为功能性肿瘤抑制因子。即使这个相对粗糙的指标，不包括Tuba-seq的前-肿瘤分辨率，也发现了sgRNAs都增加肿瘤负担的基因（图1F）。
⑦我们应用我们的实验设计来鉴定肿瘤抑制基因，这些基因通常限制肿瘤的总体生长、肿瘤的发生和异常大的肿瘤的出现（图1C；补充图S4B、S4C；方法）。
3、许多不同的肿瘤抑制基因增加了肿瘤的生长
①Tuba-seq能够量化每种基因型的数千个肿瘤的肿瘤细胞数量，这使我们能够比以前的方法更精确地评估它们对肿瘤生长的影响。我们从肿瘤大小分布中计算了两个肿瘤生长指标，以揭示灭活每个肿瘤抑制因子对整个肿瘤生长的影响（肿瘤大小分布中定义的百分位数的肿瘤大小和对数正态平均值，方法；补充图S4B）。
②正如预期的那样，在对照Cas9阴性KT小鼠中，每SLOT sgRNA/Cre载体启动的肿瘤具有非常相似的肿瘤大小轮廓，表示我们的管道没有偏压和假阳性信号（补充图S5A）。
③与先前基于Cre/lox和CRISPR/Cas9的小鼠模型（22,26,31-34）一致， KT肿瘤中Stk11/Lkb1、Pten、Setd2和Nf1的失活；H11LSL-Cas9小鼠显著增加了肿瘤生长（图2A-C；补充图S5B）。
④重要的是，STAG2（一种黏着蛋白复合物成分）的失活增加了肿瘤的生长，其程度与那些成熟的肿瘤抑制因子的失活相当（图2A-C；补充图S5B）。
⑤其他14个基因失活，包括Cdkn2c、Cmtr2、Rb1、Rnf43、Tsc1和Rbm10、150显著增加肿瘤生长（图2A-C；补充图S5）。
⑥这14个基因不仅包括成熟的肿瘤抑制因子如Rb1和Cdkn2a，还包括许多以前未被认为是肺腺癌肿瘤功能抑制因子的基因，例如，使Cmtr2和rnf43154失活的效果特别显著和出乎意料（图2B）
⑦CMTR2是唯一一种修饰mRNAs和小核RNA 5'-cap的cap2 2 2'-O-核糖甲基酶，在肺癌的~2.2%和所有癌（7,35）中突变1.4%（补充表S1），以前的研究没有研究其在癌症中的作用，也没有商业或学术性癌症基因测序面板包括CMTR2（补充图S3A和B）
4、STAG2是一种新型的功能性肿瘤抑制因子
①从我们对整体肿瘤生长抑制的初步分析来看，STAG2是一种非常有趣和新颖的肺肿瘤生长抑制因子。约4%的169例肺腺癌中STAG2发生突变，约10%的肺腺癌中黏着蛋白复合物成分发生改变（补充图S6A、S6B和表S1）。
②STAG2被认为是膀胱癌的抑癌基因，调节急性髓系白血病的谱系特异性基因，并在多种癌症类型中发生突变（39-42）。然而，之前没有研究表明STAG2是肺癌生长的关键抑制因子。为了进一步研究STAG2的抑瘤作用，我们在KT和KT；H11LSL-Cas9小鼠中用单个的Lenti-SGInerte/Cre和Lenti-sgStag2/Cre载体引发肺肿瘤（补充图S7A）。
③与对照组相比，Stag2失活显著增加了肿瘤负荷（补充图S7B-E）。KT；H11LSL-Cas9小鼠肺肿瘤中Stag2的失活也显著降低了长期存活率，与其肿瘤生长抑制功能一致（补充图S7F）。
④为了进一步描述STAG2介导的肺肿瘤生长抑制，我们用Cre/lox介导的STAG2失活评估了KT小鼠中肿瘤生长（图3A）。Stag2位于X染色体上，因此雌性小鼠的杂合子和纯合子Stag2缺失以及雄性小鼠的半合子Stag2缺失均产生缺乏Stag2蛋白的肿瘤（图3B和C）。
⑤Stag2失活显著增加了肺肿瘤负担，并且具有Stag2缺陷肿瘤的小鼠的总生存期显著缩短（图3D-G）。
⑥Stag2缺陷型和充足型肺肿瘤呈现出不典型的腺瘤性增生、腺瘤和早期腺癌，均呈NKX2-1/TTF1阳性。有趣的是，一些Stag2-缺陷型肿瘤具有核栅栏，并且在组织学上与在对照KT小鼠中形成的肿瘤不同（补充图S7G-I）。
⑦在其他癌症和细胞类型中，STAG2失活与染色体不稳定性（43,44）、DNA 损伤（45,46）的增加以及MEK/ERK或cGAS/STANG信号的激活有关（47,48）。然而，免疫组化和典型靶基因分析表明，这些机制不太可能是导致Stag2缺陷肺癌生长增加的主要因素（补充图S8A-E）。
⑧最后，为了进一步研究STAG2在肺癌中的表达，我们对479例人肺腺癌进行了STAG2免疫组织化学检测。约有20%的肿瘤STAG2蛋白表达水平较低或为阴性，表明有更大比例的肺腺癌组织中可能是由这种途径的改变所驱动的肿瘤高表达STAG2蛋白，有趣的是，STAG2-低/阴性肿瘤往往是分化程度较低的晚期人类肺腺癌（图3I）
5、后期会出现额外的肿瘤抑制作用
①为了进一步了解肺癌的抑瘤动力学，我们在肿瘤发生后的稍后时间点评估了抑癌基因的功能。我们推断，让肿瘤生长更长的时间，可能会发现对基因生长抑制的程度更大，这些基因最初的作用不大，可能会突出显示出额外的肿瘤抑制因子，它们只在肿瘤生长的后期发挥更重要的作用。为了使小鼠在肿瘤发生后能够存活更长的时间，我们生成了第二批Lenti-sgRNA/Cre载体，排除了靶向Lkb1、Pten、Setd2、Nf1、p53、Stag2、211Cdkn2c和Rb1的载体，这些载体共同占总肿瘤负担的一半以上（Lenti-212sgTS85/Cre；图4A）。
②我们在KT；H11LSL-Cas9小鼠中启动肿瘤，其滴度为Leti-sgTS85/Cre，这将允许它们存活26周，同时最大限度地增加肿瘤数量，以达到合理的统计功效（图4A；补充图S9A；方法）。作为对照组，我们还在KT、H11LSL-Cas9和KT小鼠中用Lenti-sgTS85/Cre池引发肿瘤，并在15周后对其进行分析（图4A）。
③肿瘤生长26周后，Cdkn2a、Dnmt3a、Cmtr2、Kdm6a和Ncoa6的失活显著增加了肿瘤负担（图4B）。此外，Rbm10、Cmtr2、Rnf43和Tsc1的失活也仍然增加了分布的定义百分位处的肿瘤大小，以及随后时间点的对数正态平均肿瘤大小（补充图S9B）。
④这些结果证实了这些基因的抑瘤功能。在肿瘤生长15周后，其他几个对肿瘤大小影响不大的基因，包括Keap1、Kdm6a、Ncoa6、Cdkn2a、Dnmt3a和Dot1l，在肿瘤生长26周后，肿瘤的224个大小得到了广泛增加（图4C-F）。因此，分析肿瘤发生后多个时间点的生长指标可以提供肿瘤抑制基因效应的时间分辨率
6、Tuba-seq捕获了肿瘤抑制基因功能的其他方面
①除了发现限制整体生长的肿瘤抑制基因外，我们的方法还可以量化这些基因和通路影响的癌症发生和进展的其他方面。每个lenti-sgRNA/Cre载体诱导的相对肿瘤负荷大多为，与使用定义的百分位处的肿瘤大小发现的生长效应一致（补充图S10A）
②然而，灭活某些基因对相对肿瘤负荷的影响不成比例地大（补充图S10A和B）。例如，根据相对肿瘤负荷，p53是明显的肿瘤抑制因子，但是p53失活并没有显著增加总的肿瘤生长，如对数正常平均值或肿瘤大小评估到95%的百分位肿瘤（补充图S10A）。
③其他几个基因的失活对相对肿瘤负荷的影响也比对肿瘤大小的影响更显著（补充图S10B和C）。这些相对肿瘤负荷的不成比例的增加可能是由肿瘤数量和/或最大肿瘤的大小的基因型特异性增加所驱动的，这两种情况都不能通过对数正态平均值或肿瘤大小在肿瘤大小分布的定义的得到很好的捕捉。
7、许多肿瘤抑制因子抑制肿瘤的发生
①在我们的实验设计中，我们用完全相同的慢病毒载体在KT、H11LSL-Cas9和KT小鼠队列中启动肿瘤，使我们第一次使用Tuba-seq揭示每个假定的肿瘤抑制基因对肿瘤起始和早期致癌KRAS驱动的上皮扩张的影响（补充图S4C和方法）。
②肿瘤启动后15周，对肿瘤生长有一些最显著影响的Lkb1、Setd2、254和Stag2等多个基因失活，没有增加肿瘤数量（定义为200多个细胞克隆扩张的数量；图5A；补充图S4C和方法）
③然而，Pten失活增加了肿瘤数量by~4倍，表明至少四分之三表达癌基因KRASG12D的上皮细胞 不能扩大到超过一个非常小的尺寸（图5A和B）
④Tsc1失活也增加了肿瘤数量，尽管程度较小，与Tsc1抑制PI3K下游的mTOR 一致（49）。Nf1、Rasa1和p53的失活也增加了肿瘤的数量，因此在肺肿瘤发展的早期阶段包含了几种信号通路（图5A）；令人吃惊的是，COMPASS complex（Kdm6a、Ncoa6、Kmt2c/Mll4和Kmt2d/Mll3）（50,51）的四个成员的灭活均增加肿瘤数量（图5A）
⑤由该复合物介导的组蛋白H3K4甲基化的重要性通过在8.9-32.5%的人肺腺癌中该复合物的至少一个成员的突变进一步证实（图5C和D）（2）。
⑥重要的是，限制肿瘤发生和抑制肿瘤生长的基因是独立的，表明肿瘤抑制的这些方面可以代表不同的功能（补充图S11A）。
⑦通过分析每种基因型对小鼠肿瘤数量的影响，我们有机会进一步验证抑癌基因失活对肿瘤发生和早期生长的影响（图5E；补充图S11B和C）。
⑧在所有三个数据集中，每个肿瘤抑制基因灭活对相对肿瘤数目的影响高度相关（图5F；补充图S11D和E）。
⑨一些基因包括Cdkn2a、Dnmt3a、Kdm6a 275和Ncoa6，最初只增加肿瘤数量，在适合的时间点也能提高整体生长适应度。这一观察表明，正常上皮细胞能够突破早期增生生长的限制和更适合于由此产生的肿瘤之间的一些联系（图4F和5F；补充图S9B）。
8、抑癌基因失活可导致罕见但非常大的肿瘤的出现
①接下来，我们利用Tuba-seq数据的每肿瘤分辨率来量化每个基因失活对异常大肿瘤产生的影响。除了抑癌基因失活对肿瘤生长和肿瘤发生的影响外，超大肿瘤的发生提示基因型促进或允许额外的改变来驱动肿瘤的侵袭性生长。我们以前发现p53缺失的一个主要影响是这种异常大的肿瘤的产生（26,27）。使用计量方法，如Hill's估计器（分布重尾性的一种度量方法）（52），我们对肿瘤生长15周后p53失活导致罕见但异常大的肿瘤出现的程度进行了量化（图6A和B；S12A)
②p53失活的效果与许多先前报道的KrasLSL-G12D/+；p53flox/floxmice（32,53-55）中大肺肿瘤合并的结果一致。这些分析还表明，Cdkn2a和DNA甲基转移酶Dnmt3a的失活可能使肿瘤生长到不成比例的大（图6A和B；补充图12a）。
③为了进一步研究抑癌基因失活对超大肿瘤发生的影响，我们确定了哪些基因型在肿瘤生长26周后产生了重-尾静脉肿瘤分布。对肿瘤大小分布的分析特别强调了异常大的Dnmt3a和Cdkn2a靶向肿瘤的发展（图6C-E；补充图12b-D）
④以Cdkn2a为靶点的两种sgRNAs预期都能使INK4A和ARF失活，因此Cdkn2a失活的效果可以反映Rb和p53通路的联合减少，这与我们观察到的p53失活产生重尾分布一致（图6A和B；补充图302S12A）（26,27）。
⑤在Cre/LOX304介导这些基因失活的致癌KrasLSL-G12D驱动的肿瘤中，非常大的Cdkn2a-和Dnmt3a缺陷型肿瘤的出现与肺肿瘤负荷增加一致（56,57）。然而，我们的数据的每肿瘤分辨率表明INK4A/ARF或DNA甲基转移酶DNMT3A的失活能够导致罕见但异常大的肿瘤的出现，同时对绝大多数肿瘤的生长仅产生适度的影响（图6E；补充图12c）。
⑥因此，肿瘤抑制因子在防止特大肿瘤的发生中的作用可以是，独立于它们在肿瘤进化过程中调节肿瘤起始和整体生长的作用
9、肿瘤总负荷和性别对肿瘤抑制功能的影响有限
①为了揭示整体肿瘤负担是否影响基因型特异性效应，我们将我们的KT；H11LSL-Cas9小鼠与lenti-sgTS102/Cre启动的肿瘤分为三组，分别具有低、中、高肿瘤负担，并对319肿瘤启动和生长的多重指标进行了重新评估（补充图S13A）。
②很少有基因型特异性肿瘤抑制效应受到整体肿瘤负荷的影响，表明我们的结果基本上不受随肿瘤密度变化的旁分泌或物理相互作用的潜在差异的影响（补充图S13B-E）。
③我们从雄性和雌性小鼠获得的数据使我们能够研究肿瘤抑制的性别特异性差异。大多数基因的失活，包括X 染色体上的基因，对雄性和雌性小鼠的肿瘤生长和肿瘤数量有相似的影响（补充图S14A-D）
④因此，肺癌的抑癌作用并不受性别驱动的宿主环境差异的显著影响。这对Kdm6a尤其有启发，Kdm6a是一个X连锁基因，同时具有H3K27me3 脱甲基酶和非酶功能（58）。它的非酶功能可以通过其在Y染色体上的同源性得到补偿，因此在雄性和雌性小鼠中的不同作用已被用于深入了解KDM6A的分子功能（58）。KDM6A灭活后，雄性和雌性小鼠的肿瘤数量增加相似。在肿瘤发生后15周和26周的数据中，这些效应是一致的，这表明KDM6A失活很可能是由其酶功能的丧失引起的（补充图S14E-H）。
10、敏感性和特异性评价
①为了更好地估计假阴性和假阳性对数据的影响，我们使用了数据集来估计真阳性率（方法）。在我们的所有数据集中，针对同一基因的sgRNAs的效应在多个指标中是一致的，与靶向效应一致（图2和图4；补充图S15A-F）。例如，在我们使用Lenti-sgTS102/Cre池进行的343实验中，当一个sgRNA显示出显著的肿瘤抑制效应（标称P<0.05）时，使用其他指南重新检测到显著效应的概率在所有评估指标的89%以上（补充表S3）。
②因此，两种sgRNAs未能发现与我们分析中确定的肿瘤抑制因子具有相似效应的功能性肿瘤抑制因子的346概率低于5%（补充表S3）。注意，对于从Lenti-sgTS85/Cre库中排除的8个主要肿瘤抑制基因，在每一个病例中都发现了对这两个sgrna的显著影响。
③考虑到这些结果以及每个假定的抑癌基因都有两个sgRNAs的靶向性，功能性抑癌基因不太可能因为技术原因而缺失。此外，对培养细胞中sgRNA切割的分析显示，sgrna靶向基因作为肿瘤抑制因子与那些没有作为肿瘤抑制因子的sgrna具有相当的效率（补充图S15G-I）。最后，使用我们的数据进行的功率计算表明，使用这些方法，使用合理数量的小鼠可以评估更多的基因（补充图S16A-C）。
11、人类突变数据、细胞系研究和体内功能研究在定义肿瘤抑制目录方面是互补的
①我们评估的候选抑癌基因是根据现有的人类突变数据选择的；然而，每个基因都有不同水平的相关数据支持其作为肿瘤抑制因子的功能（补充表S1）。
②我们探讨了在原地环境中对肿瘤发生的影响是否可以通过人类突变数据或通过对人类细胞系的分析来预测。基于人类突变频率数据，一些功能强大的肿瘤抑制基因并不突出，而基于人类突变数据，STAG2、CMTR2和CDKN2C等基因通常不被预测为肿瘤抑制基因（图2A；补充图S17A-G）。
因此，仅从突变数据计算肿瘤抑制功能的预测（包括已经整合背景突变率校正以及基于功能和结构的影响预测的统计方法）指定了一些但不是所有的功能性肿瘤抑制因子。
③对依赖图（59）的数据分析也显示了这一点，在依赖图中，基因组规模的敲除371筛选是在不同的癌细胞系中进行的。顶级功能性抑癌基因（包括PTEN、CDKN2C、RB1和RNF43）的失活可使肺腺癌细胞系的生长如期增长（补充图S17H）。然而，其他几种主要功能性肿瘤抑制因子（包括LKB1、SETD2和STAG2）的失活，使培养中的癌细胞生长异常减少（补充图S17H）
④尽管某些基因的失活，包括CMTR2、RBM10和KEAP1，对培养中的癌细胞具有可变或生长抑制作用，但在人类细胞系和体内小鼠模型数据中，灭活几种适度的肿瘤抑制因子的效果是一致的（4B,S17H）
Method
1、本研究中候选抑癌基因的筛选
①TCGA、GENIE、TRACERx 肺腺癌突变频率＞5%
②与KRAS共突变或不共突变
③其它癌症中突变频率＞5%
④突变频率＜5% 但是显示潜在克隆或亚克隆偏倚从TRACERx数据集，和潜在突变活性差异的基因，以及代表通常与癌变相关的生物过程或524功能的基因
⑤从一份精心策划的文献调查中，也包括了被讨论为癌症驱动基因的候选基因，即使没有任何功能数据
2、人肺腺癌基因组测序数据分析
3、肺癌抑癌基因抑癌作用的文献分析
“lung cancer” and/or “tumor suppressor” were used as the keywords to refine the search
4、基因测序板中基因内含物的计算
5、慢病毒载体的设计、产生、条形码和生产
6、Tuba seq库生成
7、Code and data availability
8、总体增长率汇总统计
9、肿瘤大小分布的重尾（heavy-tailedness）性统计
10、相对肿瘤数和相对肿瘤负荷的汇总统计
11、Bootstrapping the tumors--肿瘤引导
Hill’s estimator is a commonly used tail index to characterizes the tail shape of heavy-731tailed distributions (52). Suppose X1, X2,..., Xn are sgTS tumor sizes, and we order them by size 732such that X1 ≥ X2 ≥ ... ≥ Xn. Let Xk be the tumor size at the 95th %ile, and the Hill’s estimator is 733calculated as
The steepness (99th percentile / 95th percentile) is calculated as the ratio of the 99th