预测胶质瘤预后的铜结合蛋白的转录组学特征

今天给同学们分享一篇生信文章“Transcriptomic Characterization of Copper-Binding Proteins for Predicting Prognosis in Glioma”，这篇文章发表在Brain Sci期刊上，影响因子为3.3。

结果解读：

 铜结合蛋白的转录组表达

共有85种蛋白质被确认具有结合铜的能力。这些蛋白质主要包括依赖铜的酶，包括细胞色素c氧化酶（CCO），超氧化物歧化酶1（SOD1），氧化酶类酪氨酸酶，赖氨酸氧化酶（LOX），多巴胺β-羟化酶（DBH），铜胺氧化酶等。此外，还包括铜转运蛋白，包括铜转运蛋白1（SLC31A1/CTR1）和铜转运P型ATP酶α和β（ATP7A和ATP7B），以及铜伴侣蛋白，包括超氧化物歧化酶1的铜伴侣（CCS）和抗氧化剂-1（Atox-1），以及其他结合铜的蛋白质如金属硫蛋白等，因为这些因素严密控制着细胞内铜的生物利用度。这些结合铜的蛋白质主要参与铜的稳态调节，如图1所示。

从TCGA-GBM、TCGA-LGG和GTEX正常脑皮层数据集中提取了铜结合蛋白的基因表达情况，共找到了78个匹配的基因。主成分分析和热图显示了这三个数据集之间的明显差异。经过差异分析，作者分别在LGG vs. GTEX比较中鉴定出10个差异表达基因（DEGs），在GBM vs. GTEX比较中鉴定出15个DEGs，在GBM vs. LGG比较中鉴定出9个DEGs（图2A）。总共鉴定出了20个DEGs，如箱线图所示（图2B）。

构建和验证预测模型

为了研究基因表达与总生存时间之间的关系，作者首先分别对这20个差异表达基因进行了单变量Cox回归分析。其中16个基因显示出显著性（p < 0.05），被认为是与OS相关的候选风险因素。然后，作者进行了LASSO回归以通过计算回归系数来优化这些基因（图3A、B），最终得到了12个基因。接着，作者进行了多变量Cox回归分析以进一步优化模型，最终纳入了6个基因（ANG、F5、IL1A、LOXL1、LOXL2、STEAP3）。这6个基因的多变量和单变量Cox回归结果总结如图3C、D所示。在这6个基因中，ANG、IL1A、LOXL1、LOXL2和STEAP3在胶质瘤患者的生存中起到了风险角色（HR > 1），而F5则是一个潜在的保护因子（HR < 1）。这些基因通过单变量Kaplan-Meier生存分析进一步得到了确认（图3E-J）。

作者进一步通过使用Ivy GAP 对这六个基因的解剖转录表达进行了分析（图4）。正如预期的那样，风险因素ANG和IL1A在肿瘤区域的坏死相关区域（PAN和PNZ）中表达最高。其他风险因素LOXL1、LOXL2和STEAP3在几乎所有肿瘤区域（CT、HBVs、MVP、PAN、PNZ、IT）中表达较高，并且在肿瘤周围区域（LE）中表达最低，而保护因素F5在肿瘤和肿瘤周围区域之间没有明显变化。为了进一步验证预后基因的表达情况，作者还进行了免疫组化实验，评估了STEAP3和LOXL1的蛋白质表达情况（图5）。正如预期的那样，与正常脑区相比，STEAP3和LOXL1在肿瘤核心中显著增加。

基于六个基因，作者计算了每个胶质瘤患者的风险评分，高于或低于中位数的风险评分分别定义为高风险或低风险。高风险患者表现出增加的死亡风险和较差的生存结果（图6A）。与低风险组相比，高风险组的基因表达明显增高了ANG、IL1A、LOXL1、LOXL2、STEAP3的水平，而F5的表达水平较低（图6A）。进行了时间依赖的ROC分析，1年的曲线下面积（AUC）值达到0.87，3年达到0.88，5年达到0.82（图6B）。高风险组的总生存时间显著短于低风险组（p < 0.0001）（图6C）。

临床分层分析

如图7A、B所示，可以观察到，在TCGA和CGGA数据集中，高风险评分的患者往往年龄较大（>40岁），且具有较高的WHO分级、未甲基化的MGMT启动子、1p/19q非共删除和野生型IDH1（p < 0.05）。然而，在性别之间的风险评分上没有发现差异。

构建和验证诊断模型

为评估风险评分的独立性，作者使用单变量Cox回归分析（图7C）对上述潜在指标进行了分析。进一步对Cox p < 0.05的单一指标进行了多变量Cox回归分析，排除了VIF > 2的指标以防止多重共线性，因此剩下了五个指标，包括年龄、WHO分级、MGMT启动子状态、1p/19q缺失状态和风险评分（图7D），并将其整合到了示意图模型中（图8A）。C指数为0.852（95% CI = 0.839 − 0.865）。根据示意图，分析了ROC曲线。在TCGA数据集中，1年、3年和5年的生存率的AUC分别达到了0.88、0.94和0.88（图8B）。校准分析显示观察值与优化值之间的拟合良好，分别为1年、3年和5年的生存率。DCA表明示意图在预测生存率方面表现良好。

GSEA

为了探索高风险组和低风险组之间的差异，进行了基因集富集分析（GSEA）。在高风险组中高表达的基因在GO术语中显著富集，如“适应性免疫应答”、“胚胎骨骼系统形态发生”、“发育”、“前/后模式规范”、“区域化”，以及在KEGG通路中富集，如“IgA产生的免疫网络”、“造血细胞系谱系”和“细胞因子-细胞因子受体相互作用”。这些结果表明铜结合蛋白在胶质瘤的免疫应答中可能发挥潜在作用。

高风险评分显示免疫抑制特征

癌症免疫循环是指免疫系统如何识别和杀死癌细胞[17]。作者研究了抑制这一循环的基因表达[18]。作者发现大多数基因在高风险组中高度表达（图9A）。TGFB1、VEGFA、ARG1和IL10是胶质瘤中分泌的免疫抑制因子，而CD70是胶质瘤细胞表面的免疫抑制因子。这些基因似乎都与风险评分呈正相关（图9B-F），并且在高风险组中明显过度表达（图9G）。

免疫检查点抑制免疫系统清除肿瘤的能力[19]。与上述发现类似，与免疫检查点相关的大多数基因在高风险组中上调表达（图10A）。其中，PDCD1（PD-1）和CD274（PD-L1）在肿瘤免疫抑制和免疫治疗中起关键作用，与风险评分明显呈正相关（图10B、C）。高风险组中它们的表达明显高于低风险组（图10D）。

免疫浸润分析和突变景观

作者接下来比较了高风险组和低风险组之间的免疫浸润水平。如图11A所示，高风险组中观察到了更高水平的免疫细胞浸润，包括MDSCs、CD8+ T细胞、调节性T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞。为了进一步探索免疫特征，作者使用了ImmuneSubtypeClassifier R软件包对不同的免疫亚型进行分类[14]。作者发现，在高风险组和低风险组中，主要的亚型是C4（淋巴细胞耗竭）和C5（免疫静默），但是与低风险组相比，高风险组中可以找到更多的C4亚型（图11B）。C4亚型的特点是具有更突出的巨噬细胞特征，Th1被抑制，M2反应高，其在肿瘤中的预后比C5免疫亚型更差[14]。这与高风险和低风险的胶质瘤患者的预后一致。

作者还分析了突变情况。在低风险组中，突变发生率为98.38%，最显著的突变基因是IDH1（图12B），而在高风险组中，突变发生率为95.07%，最显著的突变基因是TP53（图12A）。有报道称IDH1突变的星形细胞瘤显示出增加的TP53突变[20]。由于TP53仍然是IDH1突变和野生型胶质瘤中最常见的突变之一，作者认为高IDH1突变不一定总是伴随高TP53突变。在风险评分和TMB之间，TMB与风险评分呈正相关（R = 0.3，p < 0.0001）（图12C），并且在高风险组中显著较高（p < 0.001）（图12D）。

总结

总之，基于TCGA、CGGA和GTEX数据集中铜结合蛋白基因集的综合分析，作者构建了神经胶质瘤的六基因预后模型。利用该模型，作者可以很好地预测神经胶质瘤患者的预后和可能的免疫治疗反应，为未来神经胶质瘤的治疗研究提供了新的方向。