文献速递||空间转录组-时空组学联盟4篇Stereo-seq模式物种文章

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2020年《Nature Methods》杂志将空间转录组学评选为Method of the year，时至今日，空间转录组的应用已然如浪潮一般，滚滚而来。

2022年5月4日，Cell杂志及其子刊Development Cell以专题形式发表了4篇基于Stereo-seq技术的空间转录组文章，专题名称为时空组学联盟：SpatioTemporal Omics Consortium (STOC)，而Stereo-seq技术正是华大自主研发的。

本文对Stereo-seq技术进行简单介绍，并展示4篇文章（小鼠、斑马鱼、拟南芥、果蝇）的主要结果。

Stereo-seq简介

Stereo-seq（spatial enhanced resolution omics-sequencing）技术基于DNB（DNA nanoball）阵列芯片和原位捕获技术研发的具有更高分辨率的空间转录组技术。技术原理如下：

1. Generation of Stereo chips：合成随机的25nt序列作为空间坐标barcode （coordinate identity，CID），以及5 '磷酸化的DNB文库oligo序列，并链接在一起，经过滚动扩增复制，形成DNB。DNB随后结合到Stereo chip上，并落入芯片中数十亿规则排列的Spot上。通过DNBSEQ测序仪对DNB进行测序，获取CID序列及对应的空间坐标。然后将22nt的poly-T序列和10nt的UMI序列和CID连接（图1A，step1-step3）。
2. 将10μm厚度的冷冻包埋组织切片贴在捕获芯片的表面，经过胃蛋白酶透化，释放的mRNA经过逆转录合成cDNA，再进行扩增、文库构建和测序，通过CID序列还原mRNA分子的空间位置（图 1A，step4-step6）。

• 纳米级分辨率

  芯片中每个Spot点的直径约为220nm，两个Spot点的中心点的距离为500nm或者715nm。x相比于其他方法，Stereo-seq每100μm²有更多的spots，spot尺寸和中心到中心的距离更小，因此分辨率更高。

  但是这里存在一个问题：一个中等大小的细胞约10μm，如此小的spot如何代表细胞呢？

  1. 首先，文章中提到Spatially constrained clustering (SCC)的聚类方法，该方法可以将多个spot分bin，以bin为单位进行聚类，用于组织学注释。bin14(14 x 14 DNB)相当于一个10μm的细胞。
  2. 然后，将核酸染色图片和Stereo-seq芯片比对，使用Scikit-image包进行细胞分割分析，划分成一个个segmented cells，并生成cell x gene矩阵，用于下游细胞注释。

• 厘米级全景视野

  最大有效捕获面积可达13cm x 13cm，可以对大尺寸组织器官进行全景图谱的绘制。

• 技术缺陷

  • Stereo-seq的高分辨率允许高效的基于图像的细胞分割，但在某些情况下，多个细胞类型彼此接近，特别是较小的细胞类型，如免疫细胞，细胞分割可能是不完美的。
  • Stereo-seq具有全基因组覆盖，但由于捕获的局限性，可能会漏掉相关低表达基因。比如果蝇文献中提到的肠干细胞和肠内分泌细胞，这些类型的细胞marker基因表达水平低。

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Cell：Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays

小鼠时空图谱：

1. 为了证明Stereo-seq的鲁棒性并证明其具有细胞分辨率解剖组织的能力，对成年小鼠冠状半脑切片进行图谱绘制。证明了Stereo-seq数据既可以通过基于bin的聚类识别大组织中的功能解剖区域，也可以通过图像引导的细胞分割识别细胞类型。

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2. 构建了小鼠器官发生时空图谱，及时空转录组数据库MOSTA。除此之外，得益于高密度信号，还可以从选定的组织中进行bin的重聚类，比如文章在E13.5脊髓组织中，确定了 ventricular zone (Hopx+), marginal zone (Slc5a7+), basal plate (Vsnl1+）等。

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3. 描绘小鼠胚胎组织细胞类型的空间异质性。比如文章中上皮细胞(Epcam+， Krt8+)可分为特殊上皮细胞亚型，包括肺中的hair follicle cells(Krt5+， Krt17+)，, alveolar type II cells (Foxp2+，Nkx2-1+)，肾上腺皮质中的 zona glomerulosa epithelial cells(Akr1b7+， Star+)，唾液腺中的 glandular epithelium (Gstm1+, Wfdc18+)，等等。

4. E16.5大脑的细胞异质性。不同解剖区域聚类识别了不同类型的祖细胞，神经元，非神经元细胞等。放大到端脑进行更详细的分析，背侧皮层脑室区产生谷氨酸能神经元，这些神经元分布在大脑皮层和海马区。侧、内侧和尾侧神经节隆起的腹室区产生GABAergic中间神经元，这些神经元分布于纹状体和苍白球，并迁移到大脑皮层。

   E16.5 Stereo-seq图谱清晰地识别了神经元间祖细胞标记(Dlx1+， Dlx2+，Lhx6 + Nkx2-1 +) 中神经节隆起(MGE)和中间神经元进入大脑皮层的迁移轨迹。 空间RNA速度分析显示，中间神经元从MGE向大脑皮层的切向迁移具有很强的方向性流动。

5. MOSTA在解剖哺乳动物遗传疾病的发育起源方面可能特别有用。为了证明这一点，选取了2429种疾病，及1959个在数据中表达的基因，描述了人类发育缺陷基因在小鼠胚胎中的表达模式。文章着重研究了WNT5A基因突变导致的Robinow Syndrome，观察到Wnt5a在上颌骨的间充质细胞和成纤维细胞中高表达，而在肢体中，它主要位于间充质细胞中，这表明两种组织的疾病机制可能不同。MOSTA可用于定义发育过程中疾病相关基因表达的时空窗口，并可用于建立潜在的缺陷。

Developmental Cell：Spatiotemporal mapping of gene expression landscapes and developmental trajectories during zebrafish embryogenesis

斑马鱼时空图谱：

1. 斑马鱼受精后（hpf）不同发育阶段的胚胎包括3.3、5.25、10、12、18、24小时，用于空间转录组分析。冷冻切片厚度15微米，Stereo-seq芯片，spot大小为220nm，中心距离715nm，芯片大小1cm²。在bin15下，构建斑马鱼胚胎时空转录图谱ZESTA（https://db.cngb.org/stomics/zesta/）。

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2. 从18和24-hpf中提取神经成分，构建神经系统的空间图谱。结果发现后脑NSCs在前向和后向以及背向和腹向表现出非同步分化。

3. 使用hotspot鉴定相似空间分布的共变基因集。24-hpf共鉴定19个modules，且和空间集群表现出一致性。其中M12在24-hpf胚胎中扩散到各种簇，包括色素细胞、红系细胞和感觉器官。通过string数据库进行PPI分析，发现TF基因sox10与来自这些细胞类型和器官的基因强相互作用。数据集为探索不同空间区域之间的基因相互作用提供了强大的工具。

4. 使用monocle2进行单细胞数据的轨迹分析，使用SPOTlight解析每个bin中的细胞类型比例，揭示了不同发育轨迹的空间动力学特征。通过整合Stereo-seq和scRNA数据，揭示了斑马鱼早期胚胎发生过程中精确的细胞分辨率、时空发育轨迹以及潜在的调控因子。

5. 计算通过不同配体-受体对之间的相对距离，鉴定潜在的互作对，平均相对距离小于5个bin的认为具有强潜在相互作用。发现有21对配体-受体通过了这些严格的过滤，包括一些Notch配体和受体(图5B)，说明了这些配体-受体对的关键作用。以Notch通路的综合分析为例，为研究不同信号通路的动力学提供了有用的数据库，以及潜在的发育调控机制。

Developmental Cell：The single-cell stereo-seq reveals region-specific cell subtypes and transcriptome profiling in Arabidopsis leaves

拟南芥时空图谱：

1. 10μm茎生叶冷冻切片，放置在四个独立的芯片上，每个芯片7个叶片样本。spot大小220nm，中心距离500nm，bin20。根据叶片的组织学特征和空间信息，将13950个细胞划分为5139个表皮细胞(上表皮细胞2,898个，下表皮细胞2,241个)，叶肉细胞7,490个(栅栏细胞4,254个，海绵状叶肉细胞3,236个)，保卫细胞377个，维管细胞944个。

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2. 拟南芥叶片的表皮可分为上表皮细胞和下表皮细胞，叶肉细胞也可分为海绵状叶肉细胞和栅栏状叶肉细胞。然而，由于细胞亚型之间的转录组高度相似，以往的scRNA-seq数据和分析单独无法区分这些细胞亚型，结合空间信息可以很轻松的划分亚型，表明了Stereo-seq技术在植物叶片细胞类型进一步划分亚型的优势。
3. 除了细胞亚型之间的功能差异外，在叶片特定区域特异表达的基因在植物的各种生物学过程中发挥着关键作用。文章将叶片主脉区划分为0区，将主脉两侧的区域划分为3个区域，分别为1、2、3区，参与光合作用的代表性基因包括LHCB6、LHCB1.2和LHCB1.3从主脉到叶缘的表达均增加，但运输相关基因如ROG1、ERD15和GAPC2的表达则降低。另外，通过不同区域的基因表达模式分析，表明空间基因表达模式对植物的生长发育起着重要的作用，对从空间角度理解植物叶片复杂功能提供了线索。
4. 众所周知，相对于更中间的区域，在叶片边缘的分化是减速的，对维管细胞的轨迹分析结果也证明了这一点。但是表皮细胞和保卫细胞的轨迹分析结果并不是这样。本研究揭示的发育阶段空间信息可为进一步研究维管细胞特殊发育阶段提供重要参考。

Developmental Cell：High-resolution 3D spatiotemporal transcriptomic maps of developing Drosophila embryos and larvae

果蝇时空图谱：

1. 胚后期(产卵后14-16 h和16-18 h，对应胚胎发生的16-17阶段，分别称为E14-16和E16-18)和幼虫全部三个阶段(L1-L3)，制作7μm和10μm切片。L1、L2，bin20，L3，bin50。

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2. 构建3D时空图谱。简单地说，先从可视化的Stereo-seq表达矩阵中提取2D图形区域，并根据形状和转录组相似性对其进行排列，从而为每个bin指定一个x-y-z 3D坐标。然后最小化每个部分的批处理效果，并在相邻的片中合并具有相同注释的簇。三维簇的轮廓和位置与胚胎和幼虫的解剖结构相似。

3. 胚胎和幼体中肠的区域化。近十年来，研究发现成虫中肠含有不同细胞形态和生理功能的亚区。使用hotspot在5个阶段的样本中识别空间上不同、功能上不同的基因模块。揭示了果蝇发育过程中消化道功能基因的。动态时空特征，并为胚胎发生过程中中肠区带的变化提供了线索。

4. 幼虫睾丸的空间细胞状态动态。进一步细分L3睾丸细胞，bin15，以已发表的单细胞幼虫睾丸数据集为参考，根据每个细胞类型的评分进行注释，鉴定了精子发生过程中的各种细胞类型，包括不同阶段的精原细胞和初级精母细胞。从mRNA丰度变化，UMAP图及RNAvelocity结果都表明了，在幼虫睾丸，从精原细胞到早期初级精母细胞再到晚期初级精母细胞的强有力的转变。

5. 果蝇发育过程中调控活动的空间模式。在发育过程中，细胞异质性的一个主要驱动力是基因调控网络(GRNs)的变化，由转录因子(tf)、辅助因子及其下游靶基因的相互作用介导。发现CG16779在胚胎和幼虫样品中具有中枢神经系统特异性调控活性，暗示其在中枢神经系统发育中具有潜在的调控功能。