一个转录组上游分析流程 | Hisat2-Stringtie

本期的教程代码（部分）

#!/bin/bash
#
# 使用fastq-dump解压sra数据
# 本数据集为双端数据
# 解压格式为fq.gz
for i in SRR6929571 SRR6929572 SRR6929573 SRR6929574 SRR6929577 SRR6929578;
do 
	pfastq-dump --split-files --threads 20 --gzip -s 00_RawData/${i}.sra --outdir 00_RawData/
    ## 质控
	fastp -i 00_RawData/${i}_1.fastq.gz -o 01_CleanReads/${i}_1.clean.fq.gz -I 00_RawData/${i}_2.fastq.gz -O 01_CleanReads/${i}_2.clean.fq.gz -q 20 -z 4 -w 20 -h 01_CleanReads/html/${i}.html
	## fastqc评估
	fastqc -q -t 30 -o 01_CleanReads/fastqc/ 01_CleanReads/${i}_*.fq.gz 
    ## 根据的信息，修改下面脚本
#mkdir 03_MappedFile/Hisat2_Mapped
#mkdir 03_MappedFile/Hisat2_Mapped/summary/
#mkdir 03_MappedFile/Hisat2_Mapped/Unmapped_reads
....
....
....
....
    done

以下为获得.sort.bam文件后进行运行。

本教程详细教程

https://mp.weixin.qq.com/s/A4cFpkrKGqPeESVQl69jcA

# 合并gtf文件
ls 04_Result/Stringtie/*.gtf > 04_Result/Stringtie/mergelist.txt
stringtie --merge -F 0 -T 0 -G 02_Geneome_index/ITAG4.1_gene_models.gtf -o 04_Result/Stringtie/gffcompare/stringtie_merged.gtf 04_Result/Stringtie/mergelist.txt
## gffcomapre注释
gffcompare -r 02_Geneome_index/ITAG4.1_gene_models.gtf -G -o 04_Result/Stringtie/gffcompare/merged 04_Result/Stringtie/gffcompare/stringtie_merged.gtf
##
## 计算FPKM
mkdir 04_Result/Stringtie/featureCounts
featureCounts -T 20 -p -t exon -g transcript_id -a 04_Result/Stringtie/gffcompare/stringtie_merged.gtf -o 04_Result/Stringtie/featureCounts/All.transcript.count.txt 03_MappedFile/Hisat2_Mapped/*.sort.bam
### 
## Count to FPKM
cat 04_Result/Stringtie/featureCounts/All.transcript.count.txt | cut -f 1,6-13 > 04_Result/Stringtie/featureCounts/01.all.count.txt
perl CountToFPKM.pl 04_Result/Stringtie/featureCounts/01.all.count.txt > 04_Result/Stringtie/featureCounts/02.all.FPKM.txt

一、写在前面

今天分享一个转录组上游分析的流程（Hisat2-Stringtie-Count），此流程的操作依旧是非常简单的。我们的流程主要使用软件的安装、数据下载、过滤、比对、Count、Count To FPKM等流程。

二、软件的安装

1. Conda软件安装

conda是常用的软件安装和管理软件，操作简单、便捷。

https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/

conda软件的下载，可下载miniconda或Anaconda。

2. miniconda（下载对应的版本）

3. Anaconda（下载对应的版本）

4. 软件的安装

5. 添加常用镜像

若是不能使用，可以自己百度一下进行搜索即可。

## Conda常使用的镜像
# 下面这四行配置清华大学的bioconda的channel地址，国内用户推荐
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/free/
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/main/
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge/
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda/
conda config --set show_channel_urls yes

# 中科大镜像源
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/pkgs/main/
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/pkgs/free/
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge/
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/cloud/msys2/
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda/
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/cloud/menpo/
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/cloud/

# 阿里镜像源
conda config --add channels https://mirrors.aliyun.com/pypi/simple/
# 豆瓣镜像
conda config --add channels http://pypi.douban.com/simple/ 
#中国科学技术大学 USTC Mirror
conda config --add channels  https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/pkgs/main/
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/pkgs/free/
conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge/

6. 创建生信环境

若是你担心自己base环境被破坏，那么就安装自己对于的小环境即可。

## 创建环境
conda create -n env_name python=x.x

## 删除环境
conda remove -n env_name -all

## 激活
conda activate env_name 
##
source activate env_name

## 关闭
conda deactivate

查看环境中的软件

# 查看指定环境下安装的package
## 查看指定环境下安装的package
conda list -n env_name

## 安装指定环境下某个package
conda install -n env_name [package]

## 删除指定环境下某个package
conda remove -n env_name [package]

## 更新指定环境下某个package
conda update -n env_name [package]

三、生信比对软件的安装

1. 安装mamba软件，mamba相对于conda安装软件，速度更快，也更容易安装。

conda install -y mamba

比对所需的软件…

1. hista2
2. Stringtie
3. subread
4. samtools
5. fastp

---

mamba install hisat2
mamba install stringtie
mamba install samtools 
mamba install subread
mamba install fastp

2. 使用源码安装
   直接下载对应的软件源码，解压后进行安装。
   

四、数据的下载

公共数据库的下载，可直接在NCBI中下载，或是使用自己测的数据即可。若你想使用公共数据库的数据，可以我们前面的教程转录组数据的下载。

五、基因组的下载

• 大部分的作物有自己基因组注释网址，我们需要自己的去寻找

模式植物中，拟南芥、番茄、 烟草等都有自己的基因组网址。

茄科类作物基因组：https://solgenomics.net/organism/solanum_lycopersicum/genome

– NCBI 中下载基因组文件

• 如果自己的物种基因组没有单独的网址，如何做呢？

可以根据NCBI中进行下载

步骤：

1. 进入NCBI官网（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
   
2. 输入需要寻找的基因组名称 （可以是作物名或是拉丁名）

，点击“search"后即可看到以下的界面，其中”Geneome"就是作物的基因组数据，点击进去。

在此界面就是我们的作物的基因组信息，有版本信息，geneome，transcript，protein,GFF，GenBank等信息。

六、数据过滤和质控检测

1. 使用FastP，主要是简单、便捷。
   软件官网：[https://github.com/OpenGene/fastp](https://github.com/OpenGene/fastp}
   

2. FastQC进行质量评估
   FastQC旨在提供一种简单的方法，对来自高通量测序管道的原始序列数据做一些质量控制检查。它提供了一套模块化的分析，你可以用它来快速了解你的数据是否有任何问题，在做任何进一步的分析之前，你应该注意到这些问题。

在处理任何样品之前的第一步是分析数据的质量。在fastq文件内有质量信息，指的是每个碱基调用的准确性（置信度%）。FastQC查看样品序列的不同方面，以确定任何影响结果的不规则或特征（适配器污染、序列重复水平等）。

本教程详细教程：一个转录组上游分析流程 | Hisat2-Stringtie****

到这里，本期教程到这里就结束了。很多的参数需要结合自己的数据进行调整。

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转录组上游分析教程[零基础]

小杜的生信筆記 ，主要发表或收录生物信息学的教程，以及基于R的分析和可视化（包括数据分析，图形绘制等）；分享感兴趣的文献和学习资料!!