每周文献 2021-08-02

大家好，最近因为有需要了解甲基化作用，看到这篇文献，拿出来给大家分享一下，这是一篇关于揭示蛋白BANP与基因组的CGCG基序结合，从而激活必需基因表达的文章。

文章题目：BANP opens chromatin and activates CpG-island-regulated genes (BANP打开染色质并激活CpG岛调节基因)

期刊：Nature

影响因子：2020_IF = 49.962; 中科大类: 综合性期刊 1区; 中科小类: 综合性期刊 1区; JCR分区: Q1

发文单位：瑞士弗雷德里克-米歇尔生物医学研究所，瑞士生物信息学研究所和瑞士巴塞尔大学等5家单位。

文章作者：瑞士弗雷德里克-米歇尔生物医学研究所Ralph S. Grand为第一作者，Dirk Schübeler 为通讯作者。

摘要：DNA甲基化是一种化学修饰，可以抑制基因的活性。哺乳动物基因组中RNA聚合酶II产生的大多数基因转录起始于CpG岛（CGI）启动子，然而我们对其调控的理解仍然有限。造成这种原因一方面是由于我们对转录因子、它们的DNA结合基序以及具体基因组结合位点在给定的细胞类型中起何种作用的信息不完整。另一方面，还有一些没有已知结合基序的孤儿基序，如CGCG元件，它与人类组织中的高表达基因相关，并在CGI启动子子集的转录起始点附近富集。在研究中，作者将单分子足迹与互作蛋白质组学相结合，以确定BTG3相关核蛋白（BANP）在小鼠和人体基因组上作为转录因子结合该元件。作者发现BANP是一种强大的CGI激活剂，可以控制多能干细胞和终末分化神经元细胞中的基本代谢基因。BANP结合在体外和体内被其基序的DNA甲基化所排斥，这在表观遗传学上限制了大多数与CGI的结合，并解释了癌细胞中异常甲基化CGI启动子的差异结合。当与非甲基化基序结合时，BANP打开染色质和核小体相。这些发现证实了BANP是一组重要基因的关键激活因子，并提出了一个模型，其中CGI启动子的活性依赖于能够打开染色质的甲基化敏感转录因子。

主要结果：
1. BANP在体内与CGCG元件结合
为了测试单个基序，作者开发了一种简化方法，将单个转录因子基序置于体外衍生序列中，并使用重组酶介导的盒交换（RMCE）将其插入小鼠胚胎干（ES）细胞的特定基因组位点。这些基序的占有率由单分子足迹（SMF）监测，SMF使用甲基转移酶足迹并通过亚硫酸氢盐测序获得（图1a）。在测试CGCG元件时，作者观察到一个显著的足迹（图1b），表明了未知因子的占有。为了鉴定结合蛋白，作者使用含有CGCG元件的寡核苷酸作为诱饵，在小鼠ES细胞核提取物中进行亲和纯化。质谱检测发现BANP是唯一的富集蛋白（图1c）。BANP是哺乳动物BEN结构域蛋白之一，被认为与核基质相关，并在转录抑制中发挥作用。接着，作者通过ChIP–seq确定检测到小鼠ES细胞中1302个可重复的峰（图1d），对前500个峰的独立k-mer富集分析确定CGCG元件为主要序列（图1e），称之为BANP基序。这些基序主要存在于启动子中，尤其是CGI启动子（图1d，f）。同时作者发现几乎90%的启动子与基序是结合的，有12%的基序位于远端（图1g）。这与BANP结合单个基序的能力不一致（图1b）。作者猜测BANP结合可能受到DNA甲基化的抑制。

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图1. BANP在体内与CGCG元件结合。a、SMF方案。通过重组酶介导的盒子交换法(RMCE)整合转录因子（TF）基序，用GpC甲基转移酶（M.CviPI）处理细胞核，并对DNA进行亚硫酸氢盐测序（BS-seq）以生成SMF图谱（甲基化百分比）。b、CGCG元件上的特定足迹。c、作为诱饵的CGCG元件通过质谱法检测BANP（3个重复， FDR<0.1，曲线弯曲（s0）为2）。d、Tubgcp5基因上的BANP结合、DNaseI可及性、基因表达（RNA）和DNA甲基化（Meth.）。e、前500个BANP峰的主要基序。f、位于CGI启动子、非CGI启动子或转录起始位点（TSS）远端超过1kb的结合BANP基序比例。g、近端和远端结合BANP位点的比例。

2. BANP对DNA甲基化敏感
在DNMT三重敲除（TKO）细胞中，BANP在野生型细胞中甲基化的其他基序处结合并打开染色质（图2a，b）。尽管大多数这些基序位于启动子的远端，但一些启动子也表现出结合增强和高表达，表明BANP为依赖性上调。为了在体外检测BANP的DNA结合，作者使用纯化的重组全长蛋白进行电泳迁移率转移和荧光偏振分析，发现BANP可以在体外特异性结合其非甲基化基序，基序甲基化使亲和力降低六倍以上（图2c）。为了确定BANP的结合特异性及其甲基化敏感性在人类细胞中是否保守，作者在两个表现出DNA甲基化异常模式的人类癌症细胞系中测定了其结合情况(图2d)，得出BANP在体外和体内特异性地直接结合到其未甲基化CGCG基序，体内结合解释了癌症特异性基因组结合事件。

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图2. BANP对DNA甲基化敏感。a、在没有DNA甲基化的情况下从头BANP结合的示例。基序中CpG的甲基化从白色变为黑色（0-100%）。WT：野生型；TKO，DNMT三重敲除。b、TKO细胞从头结合BANP基序的DNaseI信号（n=39）与两种细胞类型中的结合（n=542）。c、通过荧光偏振分析测定纯化的BANP与未甲基化、甲基化和乱序基序的亲和力（n=3个重复）。表观离解常数（Kdapp），ND，未测定。d、在人类HCT116和HCC1954癌细胞中差异甲基化的CGI启动子上的BANP结合。

3. BANP驱动重要基因表达
作者使用RMCE系统将一个具有三个BANP基序的报告基因插入基因组，并将其与已知CGI结合激活子的三个基序和已建立的强CGI衍生启动子（PGK）进行比较（图3a）。BANP基序导致表达增加近3000倍，比其他测试基序（如NRF1）至少高15倍，仅比PGK启动子低3.5倍，表明BANP基序在染色质中具有强烈的自主激活。在BANP降解后，大多数结合基因快速下调（图3b，c），同时在蛋白质组中也检测到延迟但镜像下调（图3d）。这些结果表明BANP是CGI岛调控基因的一个重要子集的有效激活剂。虽然BANP结合在神经元中大部分是保守的，但一些CGI启动子显示出差异结合（图3e，f）。

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图3. BANP驱动重要基因的表达。a、与其他转录因子和PGK启动子相比，BANP基序激活基因（3个重复）。b、使用可诱导的degron标签在BANP降解后下调Tubgcp5基因。内含子信号在1小时后已经减少。UT，未经治疗。c、BANP结合基因的RNA水平在降解过程中的变化（261个基因）。∆Exon，外显子信号的变化；∆Intron，内含子信号的变化；∆s4U，SLAM序列信号变化。d、BANP降解后TUBGCP5的Western blot（2个重复）。e、f，小鼠胚胎干细胞(ES)和神经元之间一致（e）或不同（f）的BANP靶点示例。

4. BANP在CGIs处打开染色质
作者通过ATAC-seq分析转座酶可及染色质来确定BANP对开放染色质的影响。在BANP降解后，一小时后可及性已经降低，后续变化很小（图4a，b），这表明BANP在其CGCG基序中（甚至在CGI中）一直具有较高的可及性。为了了解结合是否影响核小体及其位置，作者进行了MNase-seq，确定了结合的BANP基序周围的高相位核小体（图4a，c，）。最后，作者检测了初生组织中BANP基序是否存在开放染色质。DNaseI足迹被检测到主要在CGI（图4d），这表明BANP结合和染色质开放在所有检测的初生组织中都是保守的。

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图4. BANP在CGIs处打开染色质。a、在单个位点去除BANP后的可及性和核小体定位的丢失。b、利用ATAC-seq检测结合基序的可及性丢失。c、利用MNase seq检测结合基序处核小体相位的变化。d、在72个人体组织中，BANP-DNaseI足迹（n=381）的流行率和变异性。

在该研究中，作者鉴定出一种新的开关，它可以调控小鼠和人类基因组中的必需基因。识别缺失的基因开关及其功能对于全面了解健康和疾病的分子基础至关重要。

文中所有图片均来自BANP opens chromatin and activates CpG-island-regulated genes

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文章链接地址： https://www.nature.com/articles/s41586-021-03689-8

参考文献：
Grand, R.S., Burger, L., Gräwe, C. et al. BANP opens chromatin and activates CpG-island-regulated genes. Nature (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03689-8