拭子（痰液）核酸提取中如何高效地分离核酸

操作步骤

1. 请自行准备：无水乙醇、生理盐水、1M NaOH、1.5mL RNase-free 灭菌离心管。

2. 取出析出液和洗涤液，按以下操作：

a) 析出液：4.5mL 加入 25.5mL 无水乙醇，混匀；9mL 加入 51mL 无水乙醇，混匀。

b) 洗涤液：9mL 加入 21mL 无水乙醇，混匀；18mL 加入 42mL 无水乙醇，混匀。

c) 配制好的析出液如出现沉淀，可在 37℃溶解，摇匀后使用。

3. 样本处理：a) 拭子：向无 RNA 酶的 1.5mL 离心管中加入 800μL 生理盐水，将拭子收集的样本置于生理盐水中，涮洗 20 秒，使细胞完全脱落，贴离心管壁挤干拭子上的液体，12,000 rpm 离心 5 min，弃 700μL 上清，剩余 100μL 上清，充分振荡混匀。

b) 痰液：向收集的痰液中加入 4 倍体积 1M NaOH，室温放置 30 分钟，每 10 分钟振荡混匀一次（如痰液仍粘稠，可适当延长液化时间），12,000 rpm 离心 5 min，弃上清，剩余 100μL 上清，充分振荡混匀 15 秒。

4. 加入 200μL 裂解液和 20μL 消化液，振荡混匀，56℃水浴 10 分钟。

5. 加入 500μL 析出液，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响核酸的提取与后续实验。

6. 将吸附柱放入收集管内，将上述溶液吸入吸附柱内，静置 2 min，12,000 rpm 4℃离心 1 min，弃收集管内废液。

7. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液至吸附柱内，静置 2 min，12,000 rpm 4℃离心 1 min，弃收集管内废液。

8. 将吸附柱放回收集管内，12,000 rpm 离心 2 min，离去残留的洗涤液。同时，按每份样本 30μL 取洗脱液（如 10 份提取样本，即取 300μL洗脱液），放置于灭菌 1.5mL 离心管，65℃预热。

9. 取出吸附柱，放入新的 1.5 mLRNase-free 灭菌离心管内，加入 30 μL 上述预热的洗脱液，静置 3 min，12,000 rpm 离心 2 min，收集核酸溶液。-70℃保存，或直接用于下一步实验。

注意事项：

1. 为防 RNA 酶污染，实验过程中最好戴一次性干净手套、口罩，使用处理过的无 RNA 酶的容器和无 RNA 酶的超纯水。

2. 析出液、洗涤液均含有刺激性化学物质，请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻。如不慎沾染皮肤或眼睛，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时请就医。

3. 裂解液如有白色絮状物析出属正常现象，置于 37℃水浴中溶解即可。