Primary tumors release ITGBL1-rich extracellular vesicles to promote distal metastatic tumor grow...

本文选自nature communication,https://doi.org/10.1038/s41467-020-14869-x,喜欢的朋友可以自行下载阅读。

这图看着就知道不是3-5年能出的结果。

摘要:肿瘤转移是癌症的标志。转移性癌细胞通常以休眠状态存在于远端组织和器官中。转移前生态位形成的机制尚不清楚。在这里,我们展示了在结直肠癌(CRC)模型中,原发肿瘤向循环释放富含整合素β1(ITGBL1)的细胞外小泡(EVs),以激活远端器官中的常驻成纤维细胞。活化的成纤维细胞通过分泌促炎细胞因子如IL-6和IL-8,诱导转移前生态位的形成,促进转移癌的生长。从机制上讲,原代大肠癌衍生的ITGBL1富集的EV刺激TNFAIP3介导的NF-κB信号通路激活成纤维细胞。因此,活化的成纤维细胞产生高水平的促炎细胞因子以促进转移癌的生长。这些发现揭示了转移性肿瘤微环境中的肿瘤-基质相互作用,以及原发性肿瘤和转移瘤之间通过ITGBL1负载的EVs进行密切的信号传递。靶向EVs-ITGBL1-CAFs-TNFAIP3-NF-κB信号轴为治疗转移性疾病提供了一个有吸引力的途径。

似乎看着不是那么麻烦,但是工作量绝对很大。

作者先用转移,原位和正常的测序,发现ITGBL有持续性增多的表现,并且在转移中最多。并且作者还猜测外泌体是不是ITGBL也增多,然后测了肿瘤和正常血外泌体的ITGBL,人结直肠癌标本中ITGBL1的mRNA表达与大肠癌患者相应血浆EVs中ITGBL1的水平有很强的相关性。EV患者的ITGBL1水平与OS和DFS呈负相关,除ITGBL1外,其他几种整合素,包括ITGα6、ITGβ4和ITGβ1也存在于有肺转移的CRC患者的血浆EV中,而ITGα5和ITGβ5则存在于肝转移瘤中。这些发现支持EVs中的整合素α6β4和αvβ5在器官特异性转移中被发现.

作者不知道哪根筋搭错了,找起了上游的信号分子,在TCGA找与ITGBL相关性最高的蛋白。在来自TCGA数据集的467例CRC病例和作者的124例CRC病例中发现ITGBL1和RUNX2 mRNA高度匹配的共表达。研究了124例大肠癌组织中RUNX2的表达水平,结果表明,RUNX2在原发性肿瘤和转移灶中的表达水平显著高于非转移性肿瘤,其mRNA水平与大肠癌TNM分期呈负相关,然后验证了RUNX2与ITGBL启动子区域结合,促进了转录。ITGBL1在RUNX2过度表达细胞的EV中富集,并且RUNX2的KD在EVs中消融ITGBL1水平,在RUNX2-KD细胞中,当ITGBL1过度表达或KD时,EVs中的ITGBL1水平没有改变(图2h-j)。相同数量细胞的EV总数也因过度表达RUNX2而上调,而RUNX2的KD产生相反的效果(图2k)。RUNX2调节编码Smpd3基因的中性鞘磷脂酶2(nSMase2)的表达水平。已知nSMase2可调节神经酰胺的生物合成并触发小囊泡的分泌,作者又进行了一波验证。发现过表达nSMase2会促进EV释放,抑制会减少。真是不得不说作者在这个上面花费的经历实在太多。

下面就是EV的摄取和功能问题了。因为研究表明CAF在肿瘤中有重要作用,作者就直接看了CAF的摄取情况。将纯化的EVs静脉注射到小鼠体内。对注射的EV的体内追踪显示,CRC衍生的EV在肺或肝脏中积累,在大脑和骨髓中有非常微弱的信号。免疫荧光分析显示,大肠癌衍生的EV可被α-平滑肌肌动蛋白+肝星状细胞(α-SMA+hStCs)、肌成纤维细胞、S100A4+成纤维细胞和F4/80+巨噬细胞细胞有效吸收,但不被肝和肺中的CD31+内皮细胞吸收,从正常结肠NCM-460上皮细胞分离的对照EVs不能有效地被这些细胞类型占据。

从小鼠肺和肝中分离出原代成纤维细胞和星状细胞,接受肿瘤源性EVs治疗。IL-6、IL-8和IL-1β促炎细胞因子和纤维化标志物,如TGF-β、α-SMA和CXCL12均在ITGBL1富集的EVs处理的成纤维细胞和星形细胞中上调,

值得注意的是,富含CRC-ITGBL1的EVs增加了α-SMA+hStCs、肌成纤维细胞、FN沉积、F4/80+巨噬细胞和Ly6G+髓样细胞向肝脏(图3e,)或肺(图3f)的频率。

用含不同水平ITGBL1的EVs预处理小鼠3周,然后静脉注射肿瘤细胞作为实验性转移模型。

在原位结直肠癌模型中,癌细胞被植入cucum,富含ITGBL1的EVs也能加速肝转移瘤的生长(图4e,f)。几乎所有的大肠癌EVs小鼠都发生了肝转移,而只有16.7-33.3%的大肠癌EVs治疗小鼠发生了肺转移,对已知肌纤维母细胞标志物α-SMA的免疫荧光分析表明,用富含ITGBL1的EV治疗可增加转移病灶中的α-SMA+CAFs

从上述肺和肝转移性病变中分离出的CAF表达高水平的IL-6、IL-8、IL-1β、α-SMA、TGF-β和CXCL12。

作者提出了富含ITGBL1的EV是否参与成纤维细胞活化的问题,首先要解决的是高转移的是不是有更多的ITGBL,通过对从等量细胞中分离出的EVs的定量分析,高转移癌细胞比低转移癌细胞分泌了大量的EVs.然后体外培养,看看CAF活化的问题。作者在补充材料里验证了这些。

接着就是为什么CAF可以产生这些细胞因子了。作者不明所以,直接拉出了NF-κB这个通路,证明了一波,也是很有意思,只能说这些细胞因子都研究烂了,所以一提到就是NF-κB就好使。

那ITGBL怎么激活NF-κB的呢?作者作了ITGBL的co-ip打个质谱,发现了TNFAIP3,免疫荧光分析也显示ITGBL1和TNFAIP3共定位,接着验证就完了,套路都是一样的。

作者接着看看CAF过表达ITGBL对肿瘤的作用。首先是对肝形状细胞和肺内皮细胞的作用,然后与肿瘤共培养看看,用来自ITGBL1过度表达WI-38或LX-2的条件培养基处理HCT116细胞,可增强茎干基因表达和球体形成能力,此外,使用条件培养基预培养HCT116细胞,我们发现体内相同的条件培养基促进了大肠癌的致瘤性(图7i,j)。在皮下移植肿瘤中,我们进一步证实了用ITGBL1过度表达WI-38或LX-2的条件培养基治疗的肿瘤中,stemness基因表达增强

在条件培养基处理的HCT116细胞中,上皮-间充质转换(EMT)相关基因的表达也发生改变,导致E-钙粘蛋白下调,波形蛋白、蜗牛和FN上调,无论是肝星状细胞还是肺成纤维细胞的高表达ITGBL的上清都促进了肿瘤肝肺转移以及原位肿瘤的生长。

最后一段说了原代的纤维细胞与活化的纤维细胞对肿瘤的作用差异,其实和上面的结果有些重复,就不放了,总之,好文章,欢迎批评、指正。

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