Primary tumors release ITGBL1-rich extracellular vesicles to promote distal metastatic tumor grow...

本文选自nature communication，https://doi.org/10.1038/s41467-020-14869-x，喜欢的朋友可以自行下载阅读。

这图看着就知道不是3-5年能出的结果。

摘要：肿瘤转移是癌症的标志。转移性癌细胞通常以休眠状态存在于远端组织和器官中。转移前生态位形成的机制尚不清楚。在这里，我们展示了在结直肠癌（CRC）模型中，原发肿瘤向循环释放富含整合素β1（ITGBL1）的细胞外小泡（EVs），以激活远端器官中的常驻成纤维细胞。活化的成纤维细胞通过分泌促炎细胞因子如IL-6和IL-8，诱导转移前生态位的形成，促进转移癌的生长。从机制上讲，原代大肠癌衍生的ITGBL1富集的EV刺激TNFAIP3介导的NF-κB信号通路激活成纤维细胞。因此，活化的成纤维细胞产生高水平的促炎细胞因子以促进转移癌的生长。这些发现揭示了转移性肿瘤微环境中的肿瘤-基质相互作用，以及原发性肿瘤和转移瘤之间通过ITGBL1负载的EVs进行密切的信号传递。靶向EVs-ITGBL1-CAFs-TNFAIP3-NF-κB信号轴为治疗转移性疾病提供了一个有吸引力的途径。

似乎看着不是那么麻烦，但是工作量绝对很大。

作者先用转移，原位和正常的测序，发现ITGBL有持续性增多的表现，并且在转移中最多。并且作者还猜测外泌体是不是ITGBL也增多，然后测了肿瘤和正常血外泌体的ITGBL,人结直肠癌标本中ITGBL1的mRNA表达与大肠癌患者相应血浆EVs中ITGBL1的水平有很强的相关性。EV患者的ITGBL1水平与OS和DFS呈负相关,除ITGBL1外，其他几种整合素，包括ITGα6、ITGβ4和ITGβ1也存在于有肺转移的CRC患者的血浆EV中，而ITGα5和ITGβ5则存在于肝转移瘤中。这些发现支持EVs中的整合素α6β4和αvβ5在器官特异性转移中被发现.

作者不知道哪根筋搭错了，找起了上游的信号分子，在TCGA找与ITGBL相关性最高的蛋白。在来自TCGA数据集的467例CRC病例和作者的124例CRC病例中发现ITGBL1和RUNX2 mRNA高度匹配的共表达。研究了124例大肠癌组织中RUNX2的表达水平，结果表明，RUNX2在原发性肿瘤和转移灶中的表达水平显著高于非转移性肿瘤，其mRNA水平与大肠癌TNM分期呈负相关，然后验证了RUNX2与ITGBL启动子区域结合，促进了转录。ITGBL1在RUNX2过度表达细胞的EV中富集，并且RUNX2的KD在EVs中消融ITGBL1水平，在RUNX2-KD细胞中，当ITGBL1过度表达或KD时，EVs中的ITGBL1水平没有改变（图2h-j）。相同数量细胞的EV总数也因过度表达RUNX2而上调，而RUNX2的KD产生相反的效果（图2k）。RUNX2调节编码Smpd3基因的中性鞘磷脂酶2（nSMase2）的表达水平。已知nSMase2可调节神经酰胺的生物合成并触发小囊泡的分泌，作者又进行了一波验证。发现过表达nSMase2会促进EV释放，抑制会减少。真是不得不说作者在这个上面花费的经历实在太多。

下面就是EV的摄取和功能问题了。因为研究表明CAF在肿瘤中有重要作用，作者就直接看了CAF的摄取情况。将纯化的EVs静脉注射到小鼠体内。对注射的EV的体内追踪显示，CRC衍生的EV在肺或肝脏中积累，在大脑和骨髓中有非常微弱的信号。免疫荧光分析显示，大肠癌衍生的EV可被α-平滑肌肌动蛋白+肝星状细胞（α-SMA+hStCs）、肌成纤维细胞、S100A4+成纤维细胞和F4/80+巨噬细胞细胞有效吸收，但不被肝和肺中的CD31+内皮细胞吸收，从正常结肠NCM-460上皮细胞分离的对照EVs不能有效地被这些细胞类型占据。

从小鼠肺和肝中分离出原代成纤维细胞和星状细胞，接受肿瘤源性EVs治疗。IL-6、IL-8和IL-1β促炎细胞因子和纤维化标志物，如TGF-β、α-SMA和CXCL12均在ITGBL1富集的EVs处理的成纤维细胞和星形细胞中上调，

值得注意的是，富含CRC-ITGBL1的EVs增加了α-SMA+hStCs、肌成纤维细胞、FN沉积、F4/80+巨噬细胞和Ly6G+髓样细胞向肝脏（图3e，）或肺（图3f）的频率。

用含不同水平ITGBL1的EVs预处理小鼠3周，然后静脉注射肿瘤细胞作为实验性转移模型。

在原位结直肠癌模型中，癌细胞被植入cucum，富含ITGBL1的EVs也能加速肝转移瘤的生长（图4e，f）。几乎所有的大肠癌EVs小鼠都发生了肝转移，而只有16.7-33.3%的大肠癌EVs治疗小鼠发生了肺转移，对已知肌纤维母细胞标志物α-SMA的免疫荧光分析表明，用富含ITGBL1的EV治疗可增加转移病灶中的α-SMA+CAFs

从上述肺和肝转移性病变中分离出的CAF表达高水平的IL-6、IL-8、IL-1β、α-SMA、TGF-β和CXCL12。

作者提出了富含ITGBL1的EV是否参与成纤维细胞活化的问题，首先要解决的是高转移的是不是有更多的ITGBL,通过对从等量细胞中分离出的EVs的定量分析，高转移癌细胞比低转移癌细胞分泌了大量的EVs.然后体外培养，看看CAF活化的问题。作者在补充材料里验证了这些。

接着就是为什么CAF可以产生这些细胞因子了。作者不明所以，直接拉出了NF-κB这个通路，证明了一波，也是很有意思，只能说这些细胞因子都研究烂了，所以一提到就是NF-κB就好使。

那ITGBL怎么激活NF-κB的呢？作者作了ITGBL的co-ip打个质谱，发现了TNFAIP3，免疫荧光分析也显示ITGBL1和TNFAIP3共定位，接着验证就完了，套路都是一样的。

作者接着看看CAF过表达ITGBL对肿瘤的作用。首先是对肝形状细胞和肺内皮细胞的作用，然后与肿瘤共培养看看，用来自ITGBL1过度表达WI-38或LX-2的条件培养基处理HCT116细胞，可增强茎干基因表达和球体形成能力，此外，使用条件培养基预培养HCT116细胞，我们发现体内相同的条件培养基促进了大肠癌的致瘤性（图7i，j）。在皮下移植肿瘤中，我们进一步证实了用ITGBL1过度表达WI-38或LX-2的条件培养基治疗的肿瘤中，stemness基因表达增强

在条件培养基处理的HCT116细胞中，上皮-间充质转换（EMT）相关基因的表达也发生改变，导致E-钙粘蛋白下调，波形蛋白、蜗牛和FN上调，无论是肝星状细胞还是肺成纤维细胞的高表达ITGBL的上清都促进了肿瘤肝肺转移以及原位肿瘤的生长。

最后一段说了原代的纤维细胞与活化的纤维细胞对肿瘤的作用差异，其实和上面的结果有些重复，就不放了，总之，好文章，欢迎批评、指正。