Flowjo处理凋亡结果

原理：

凋亡blank不是最好的阴性对照，应该是用IGg同型对照最好，所以圈门可以根据单染FITC和PI来看结果。
FITC标记的 Annexin V 染色先于细胞凋亡或细胞坏死过程中伴随产生的细胞膜完整性丧失的出现。因此，利用FITC标记的Annexin V染色时通常结合活体染料如碘化丙啶（PI）或7-Amino-Actinomycin（7-AAD），方便研究者鉴定出早期凋亡细胞（PI阴性，FITC Annexin V阳性）。具备完整细胞膜的活细胞可以阻止PI浸入，然而细胞膜坏死或破坏后就可以浸透PI。

• 活细胞检测结果应该是FITC Annexin V 阴性和 PI 阴性；
• 早期凋亡细胞是FITC Annexin V 阳性 and PI 阴性；
• 晚期凋亡细胞或已死亡细胞是FITC Annexin V 阳性和 PI阳性。
• 此检测不能区分出经历过凋亡的死细胞和经历其它坏死途径的死细胞，因为二者都会同时被FITC Annexin V 和 PI染色。然而，持续观察细胞凋亡都会经历三个阶段：FITC Annexin V 和 PI 都是阴性（活细胞或没有明显细胞凋亡）；Annexin V阳性 和 PI 阴性（凋亡早期，具有完整细胞膜）；FITC Annexin V and PI 都是阳性（凋亡晚期或死亡）。经历这三个阶段的细胞表明是经历细胞凋亡过程。相反，单一观察显示细胞FITC Annexin V和 PI都是阳性不能反映出细胞是否经历凋亡过程。

软件操作：

1. 圈细胞+分门

   • 打开flowjo软件，将要分析的fsc文件直接拖入软件中
   • 双击其中一个，调节横坐标为“FSC-坐标liner处理” 纵坐标为“SSC-坐标log处理”，并用像“箭头”一样的圈出待分析的细胞群，可将细胞命名或默认为“lymphcytes”
   • 此时可以进行批量处理圈细胞群，将圈出的“lymphcytes”拖到软件上方的“all samples”，其他样品自动圈出，可以在图片显示屏中挨个查看其他圈群是否合理，进行细微调整，可不将细胞碎片圈入。
   • 选中圈好的细胞群，双击细胞群处或者点击主界面的“lymphcytes”
   • 调节横纵坐标：调节横坐标为“FITC-坐标log处理” 纵坐标为“PI-坐标log处理”，并选择十字架✝️标识的四分门设门工具进行分门。圈门后再批量处理将圈出“Q1, Q2, Q3 ,Q4”全选拖到软件上方的“all samples”
   • 微调：在批量处理后，展示细胞图片的小窗口右上角有向左向右翻看的绿色箭头，可以将所有的样品查看，并个别样品可以进行微调处理。

2. 批量处理图片

   • 第一步：在图片显示的小窗口打开的情况下，点击“edit” --- “copy to layout editor” 可以看到图片显示
   • 第二步批量添加图片：在“layout editor”界面点击旁边的螺丝标志的“Batch”点击内部的create batch report(可选择一下一行访多少张图)，所有的图片全部自动导入。
   • 第三步调整：双击图片后点击“annotation” 可对横纵坐标重新命名，也可以隐藏本有的横纵坐标”hide label“; 也可以点击鼠标右键，点击"annotation"选择要不要描述图片的信息，点击“backgating”可显示圈门的情况
   • 导出图片：选择“file”中的“image import”选择图片格式，建议选择矢量图PDF文件，进一步可通过添加到PS再软件次导出高清的300dpi的tiff文件。（弱直接导出tiff格式分辨率为1dpi）

3. 导出excel表格数据

   • 在软件“flowjo”界面下的“table editor”将要分析的结果拖入
   • 点击右上角的螺丝标志“create table”, 注意有时候table会出现在下面看不到。可以复制到excel表中
   • 此时可以将某一个养你的Q2（晚凋）和 Q3（早凋）一起拖入“table editor”洁面，然后将出现的数值复制到excel表中，可以利用shift键（按住第一个数值和最有一个要复制的数值）。
   • 通过prism制作柱状图，纵坐标：percentage of apoptosis cell (%)