文献阅读-ONECUT2 is a driver of neuroendocrine prostate cancer

1 术语|背景知识

• NET 神经内分泌肿瘤
  起源于全身任何部位神经内分泌细胞的肿瘤，广泛分布于人体，不仅存在于一些内分泌器官或组织，还散在分布于支气管、肺、胃肠道、胰腺、胆管和肝脏等。
• 缺氧 肿瘤
  肿瘤组织普遍缺氧，若要继续生长必须依赖新血管的生成供给其所需的养分，否则肿瘤组织将无法继续生长甚至凋亡。
• CRPC castration-resistant prostatic adenocarcinoma
  许多早期前列腺癌需要正常水平的睾丸激素才能生长，但去势抵抗的前列腺癌则不然。 即使体内睾酮的量减少到非常低的水平，前列腺癌仍在继续增长。 也称为CRPC。(from NCI Dictionary)
• NEPC (neuroendocrine prostate cancer) 神经内分泌前列腺癌
  PCa (prostate cancer) 前列腺癌
• molecular signature database (MSigDB)
  定义了已知基因集，包括H和C1-C7八个系列（Collection/cluster）

image.png

ONECUT2 is a potential master transcriptional regulator of poorly differentiated neuroendocrine tumors

• 数据来源：
  1. 两个adeno-CRPC和NEPC数据集 Beltran 和 Lin
  2. CCLE中细胞系
     • 神经系统肿瘤中的NET（neuroblastoma）、non-NET（glioma）
     • 肺癌中的NET（small cell lung cancer）、non-NET(non small cell cancer)

筛选出在NETs中共同上调的基因88个，经人转录因子集过滤后剩9个转录因子

image.png

• 在CCLE的NETs和Beltran的NEPC中进行相关性分析,基于Gephi的分组，进行网络图的绘制 ，top community由60%的基因组成，从中挑选出5个top weighted degrees 的转录因子，认为其可能是关键的内分泌肿瘤转录调节因子**

  
  
  image.png

• 分析这5个转录因子在肿瘤和正常样本中的表达情况，其中ONECUT2为最广泛被上调的转录因子

  
  
  image.png

ONECUT2 expression increases during PCa progression

• 小鼠模型DKO（表型与NEPC类似）与SKO和wt，onecut2表达明显升高；良性的前列腺组织、原发性腺癌、转移性CRPC肿瘤的OC2表达对比，看出CRPC中OC2的表达量明显升高；在CRPC和NEPC的比较中，OC2的表达差异更为明显；

  
  
  image.png
  image.png

ONECUT2 regulates hypoxia signaling in NE-like PC3 cells

• siRNA敲除ONECUT2后，PC3细胞的增殖速度明显下降；

  
  
  image.png

• shRNA敲除ONECUT2后，抑制了PC3xenograft的肿瘤增殖；

  
  
  image.png
  
  
  image.png

• GSEA方法，在ONECUT2调节的基因中发现了ANGIOGENESIS和HYPOXIA信号通路的富集

  
  
  image.png
  
  
  image.png

• 对缺氧条件下的ONECUT2敲除的PC3细胞进行RNA-seq，GSEA发现，缺氧条件下，HYPOXIA和GLYCOLYSIS信号通路富集；

  
  
  image.png

• 常氧和缺氧条件下，ONECUT2( /-)的PC3细胞的120个缺氧诱导基因的表达情况（热图和GSEA富集）

  
  
  image.png

• 120个基因中的25个，在缺氧条件下，被ONECUT2显著上调，包括经典的HIF驱动基因。

  
  
  image.png

• 缺氧条件下，ONECUT2敲除的肿瘤表现出的缺氧状态明显低于control组；缺氧条件下，PC3细胞的迁移和侵袭能力明显升高，但ONECUT2敲除后，这种现象不再存在；

  
  
  image.png

ONECUT2 regulates HIF1α binding to the chromatin

• 从western上看出，缺氧条件下，HIF-1α 的蛋白表达不受OC2敲除与否的影响，反之亦然；

  
  
  image.png
  
  
  image.png

• ChIP seq分析表明ONECUT2敲除组，HIF1α genomic occupancy减少；
  发生位置位于ANGPTL4和ADM基因附近；

  
  
  image.png
  
  
  image.png
• HIF1α 结合位点在ONECUT2上调基因组（？odds ratio的得来，我表示没有看懂）;RT-qPCR表明，缺氧条件下，ONECUT2敲除组ANGPTL4 and ADM的表达明显减少。
  
  image.png
  
  
  image.png

ONECUT2 mediates HIF1α genomic binding through activation of SMAD3

• 只有8.4%ONECUT2 结合位点与7.6%HIF1α结合位点彼此重合，说明，ONECUT2的敲除在HIF1α 与基因结合减少中只是很小一部分的原因；
• ONECUT2直接上调基因，经HIF1α结合位点处的motif过滤后，再经BioGRID列表中的HIF1α相互作用蛋白过滤后，只剩下SMAD3;（下面是原文的说法，我感觉我没理解透）

58 ONECUT2 direct upregulated genes ;This gene list was then filtered by motifs enriched in HIF1α binding sites in control PC3 cells compared
with ONECUT2 knockdown cells.Further filtering with HIF1α interacting proteins(list from BioGIRD) pinpointed SMAD3 as a candidate HIF1α co-factor activated by ONECUT2.

image.png

image.png

• 在常氧和缺氧条件下，SMAD3的启动子区附近发现了ONECUT2的结合；而且，ONECUT2敲除后，RT-PCR和western表明SMAD3的RNA和蛋白质的含量降低；

  
  
  image.png
  
  
  image.png

• SMAD3敲除后，HIF1α 的chip-seq信号整体下降；

  
  
  image.png

• 进行了SMAD3_ChIP、HIF-1α_ChIP、SMAD3_ChIP-HIF-1α_reChIP，在reChIP获得的基因中有87%与单独结果有交集；且位于ANGPTL4 和ADM基因处，说明与缺氧诱导的基因相关性最强；

  
  
  image.png
  
  
  image.png

ONECUT2 and hypoxia synergize to drive neuroendocrine plasticity

• LNCaP cells过表达ONECUT2后，诱导了NEPC标志物ASCL1, PEG10和NSE的表达；

• OC2过表达和缺氧条件能够协同导致PEG10的表达升高；

• OC2过表达和缺氧条件能够协同导致92个pan-NET基因的表达升高；

• OC2过表达和缺氧条件能够协同导致核心转录因子的表达升高；

  
  
  image.png
  
  
  image.png
  
  
  image.png

• 缺氧条件下，ONECUT2在MYT1启动子区和INSM1、ZNF711的增强子区的结合增强 ；

  
  
  image.png
  
  
  image.png

• ONECUT2和缺氧条件协同诱导LNCaP cells 中EMT和stem cell相关基因表达的升高；

  
  
  image.png

• ONECUT2和缺氧条件能够协同抑制LNCaP细胞中雄激素诱导基因的表达，与临床上内分泌肿瘤转分化过程中AR信号通路被抑制的现象一致；

• ONECUT2和缺氧条件均能导致LNCaP cells的神经生成, 而且两种条件结合会增强该效应；

  
  
  image.png

NEPC with ectopic ONECUT2 expression is highly hypoxic

• CA9 的IHC染色从两种TMA和图片均表现出在NEPC显著增强；AR 染色表现出降低、SYP表现出升高；

  
  
  image.png
• Beltran adeno-CRPC/NEPC数据集中ONECUT2得分与Hypoxia得分在NEPC中相关性更强

Hypoxia得分和ONECUT2上调基因得分由各自相应基因的z-score加和而来，Hypoxia得分基于32个前列腺癌特定缺氧相关标志基因，ONECUT2得分基于缺氧条件下的PC3细胞中123个ONECUT2上调基因而来 。

• 缺氧的激活的前体药物-TH302，能够抑制PC3肿瘤的增殖，OC2被敲除后，肿瘤抑制作用消失；
• OC2过表达，PIMO染色明显增强；缺氧的激活的前体药物-TH302，对V16A肿瘤增殖无抑制作用，过表达OC2后，出现肿瘤抑制效应；

• 经TH-302周治疗后， 对NEPC PDX肿瘤抑制效应明显 (tumor
  inhibition rate = 84.5%),但是对adeno-CRPC肿瘤抑制作用相对弱；

  
  
  image.png