最近WB遇到的问题

       最近感觉压力很大，实验做不出来，系统不稳定，早上起不来，晚上睡不着，课题没进展，觉得老板眼界狭窄。

      可能自己就是想逃避问题，每次遇到困难了，首先就是激素作乱，让自己失去动力，陷入焦虑。

       这个实验，一星期之内我一定要做出来，做出稳定的系统就不要变来变去了，元旦放假才好去找大咪，才能玩的开心。我需要加强一下自律能力，早睡早起，把自己的作息调整到一个正常的节奏，从饮食和运动两个方面督促自己做一个健康的咪。

#实验篇：

我没想到啊，做WB的实验竟然这么难，哪个环节出现问题都会导致两天的努力功亏一篑。最近Actin和GAPDH这样的Loading我都跑不齐，就感觉很难受。最近的问题，总结如下：

1.Loading的条带大小不均一：

说明制样后蛋白浓度测不准，导致上样量不一致。另外，如果上样量需求大，但超过胶孔的承载力，我将EP管放在金属浴上蒸发了10min，40ul样品剩下大概10ul，最后跑出来的条带并不均一，所以我认为，这样蒸发其实对蛋白的浓度是有影响的，跑出来会不准。

2.条带歪扭

我翻看了在这个实验室最早期的WB的结果图，发现loading的两条带歪成八字形，查了一下，可能是因为电泳槽底部有气泡，导致电场不均一。所以，下次再做WB，PAGE胶要先配，加促凝剂之前要先在要床上摇10min，最后加促凝剂，混匀后加到胶板里。胶最好要提前配，不要配好了立刻就用，因为胶可能凝的并不是很彻底。最好头天配好，第二天做实验。

3.溴酚蓝拖尾

肉眼可见，在跑胶过程中，PAGE胶的泳道显蓝色，这种溴酚蓝拖尾的现象可能是因为样品溶解不好，也可能是因为上样量太大了。

4.条带弥散

昨天的结果很令人惊讶，条带十分弥散。网上有人说，这种情况是因为上样量太大导致了。我本来还以为自己上样量太小了，因为目的条带压不出来，所以在第二次跑的时候还可以提高了上样量，看来昨天的实验又唧唧了。再加上PAGE胶配好就用了，我担心它凝固地不是很彻底。

条带弥散

5.其他

电压能调错，胶可以被碰坏，胶能配错......最近一段时间就感觉自己做实验很离谱。

6.制样

还有制样地问题，我之前用研磨地方法，我总感觉研磨地方法不好质量控制，而且我之前地操作好像也不是很规范，所以，我想着用匀浆地方法，称好重量。但由于我故作聪明，在里面加了巯基乙醇，导致无法用BCA做蛋白定量，所以我对自己地这次实验又是充满怀疑。我后来问了同学，他们组的制样方法，他跟我说的很详细，我决定用他的方法认认真真地制样。

肝脏组织大概小指甲盖的体积，可以加1ml裂解buffer（他们组用的是SDS+NP40，我还是决定用自己配的SDS裂解buffer），全程在冰上；

每管加一大四小的匀浆珠；

下楼匀浆，2*cycle，stop 10s，speed 6000，肝脏组织很好匀浆；

超声：15%的脉冲，2s一次，3-5次每管；

放在四度摇10-15min，让组织充分裂解；

离心取上清，测浓度，制作标曲；

加含有巯基乙醇的loading；

100度煮5min，2min时开盖；

上样，跑胶；

好的蛋白是成功的一半，好的开始是成功的一半。不然以后的实验都没法做了。我们不图快，但每一步都要做的扎扎实实，有据可循。