生物学实验--引物设计

原则

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；

2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。至少要在55-80℃之间。

4、引物3’端的碱基一般不用A。A在错误引发位点的引发效率相对比较高。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

6、 尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增。

7、 使用BLAST检索，确认引物特异性。Max Self Complementarity 缺省值是8.00，Max 3' Self Complementarity 缺省值是3.00

进入NCBI ，选择BLAST

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。BLAST结果中的得分是对一种对相似性的统计说明。

NCBI的Primer-BLAST页面，提交的界面主要包括四个部分：PCR template（模板区）, Primer Parameters（引物参数区）, 和Exon/intron selection（外显子内含子选择区），Primer Pair Specificity Checking Parameters（验证引物特异性）

在PCR Template下方文本框中我们也输入FASTA格式的序列或Accession Number，或点击“选择文件”载入FASTA格式的文件。右侧可以设置正向引物和反向引物的起始和终止位置。在“Primer Parameters”模块，可以输入PCR产物的大小（PCR product size）和Tm值参数。如何你已经设计好了物，要拿来验证引物的好坏，可以在此输入。引物Tm温度接近，设置差2℃。

NCBI BLAST点custom可以导入自己的DNA文件进行比对。

注：

NCBI上是基因负链。

基因正链=有义链=编码链，基因负链=反义链=模板链。