学习：StatQuest-Normalization

前言

我们先来辨析一下归一化和标准化的区别
归一化目的：

1. 消除量纲
2. 将数据缩放到[0,1]之间
   比较常用的是Z-score
   而标准化也是对数据进行缩放，但是它不会改变各样本间的生物学差异，只不过也是将数据缩放到一定的范围内，并且统一量纲，方便观察和计算
   接下来我们讨论下在差异分析中的标准化

DESeq

我们之前知道标准化的方式有RPKM，FPKM和TPM，但是DESeq并不采用这些方式，可能是DESeq的最终目的是想找出差异基因，即是相同基因的不同处理相比较，对于相同的基因，那么就没必要太过于纠结其长度带来的影响（因为都是一样长）
至于文库深度所带来的影响，DESeq采用另外一种方式来解决，为什么不统一文库深度呢？这里举个例子

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假设我两个样本，它们的测序深度均为635条reads，那么基因A2M只在sample1中表达，而且是高表达，635中占据了563，那么剩下的基因分的的reads数就很少
由于2代测序中PCR的偏好性，就不太好说是其他（除A2M外）基因真的表达少，还是测序集中测了A2M而忽略其他基因的表达,所以单纯的将文库深度标准化会带来这个问题
基于客观事实，这两个sample只有A2M是差异表达基因，DESeq采用的方式是基于一个假设，那就是大部分基因都不差异表达

那下面我们就看一下DESeq是如何工作的：

1. 去除离群值

   
   
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2.对基因的count数取对数值（log2和log10就可）

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并且把无限值去除，记住是将这整个基因的这一行都去掉

3. 对每一行（每一基因）求均值

   
   
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   这里是上述基因的均值

4. 对应样本的基因减去对应基因的均值

   
   
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   记住，是取了对数的count值相减，如果没有取对数，则按照下面式子计算：

   
   
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5.对于每一列（每一个样本）求中位数

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剪完均值以后，求每一列的中位数

6. 对每一列的中位数取指数

   
   
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   这些值对应每一列的标准化因子

7. 原始count矩阵除以对应列标准化因子

   
   
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   我们将原始count矩阵除以对应列标准化因子，则得到我们标注化好的矩阵

总结几点：

1. 上述第3，4步其实就是综合了不同测序深度带来的影响，把它们拉一下，消除影响

2. 上述第5步求中位数既是按照大部分基因都不差异表达的加设来选择的，以这些基因为标准来作比较，因为中位数都是排序计算的，对于不同样本来说，离中位数近的数值，两个不同样本间经过这样处理的相应基因差异就不会太大，只有里中位数远的数值，两个不同样本间经过这样处理的相应基因差异会产生显著差异

edgeR

这款软件的标准化同样不是采用RPKM，FPKM和TPM的方式进行标准化，至于原因的话，可以参照下DESeq的原因，这里不再赘述
那么我们就分步骤来看看edgeR是怎么工作的：

1. 去除不表达的基因

   
   
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   在该模型中gene5被剔除

2. 选取一个sample作为参考样本

   
   
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   以该样本标准化其他样本
   如何区分好的样本和坏的样本：

   
   
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   比方说sample3就是一个不好的样本，很多都是0
   一般来说，edgeR需要确认一个满足均匀分布的样本：
   

   首先，我们计算出所有的sample总的reads数

   
   
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   然后对应sample的对应的每个基因分别除以各sample的总reads数

接下来确认某一分位数，比方说75%，在sample1中0.26即为75%分位数，即sample1 中有75%的数值小于或者等于0.26
依次求出其他sample的75%分位数

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然后对各样本的的75%分位数取均值

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然后选取与各样品75%分位数均值最相近的某样本75%分位数，以该样本作为参考样本

3. 选择合适的基因计算换算系数

   
   
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   对于原始count矩阵，我们已经选取了sample1为参考样本，我们把目光聚集到sample1和sample2上：

   
   
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   我们把sample1和sample2中对应的基因以reads数来画图，如上图，横轴为某基因的reads是在参考样本多还是在sample2 中多；纵轴表示某基因的reads数多还是少（推测该reads数是指参考样本和sample2的reads数总和）
   我们选取的参考基因应该是红色区域的基因

4. 标准化并选取参考基因
   法一：

   
   
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   对应的基因按照上述公式进行标准化，目的是识别有偏差的基因，并且移出无限值
   法二：
   也可以取对数值计算几何平均数进行标准化，目的是识别两个样本中高转录和低转录的基因

   
   
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我们由这两个方法可以得到两个表格

法一

法二

并且将这两张表格按数值从小到大排列：

法一

法二

最后，这两张表分别过滤掉前后30%偏差较大的基因和比较高和比较低表达的基因：

4. 计算剩余的比率对数的加权平均值
   这里的剩余，是指步骤3中被排除的30%的基因

   
   
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   即sample1（参考样本）除以sample2的对应基因，再取log值

5. 计算标准化因子
   步骤4中，将表中的log2(ratio)求个均值，然后按照下述公式计算标准化因子：

   
   
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6. 中心化标准因子及标准化

   
   
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   这是个例子，比方说左图的WT2是参考样本，每个基因和自己比的加权对数平均数均为1；右图是将这4个样本的标准化因子中心化
   接下来，每个样本的每个对应基因的原始count数除以对应样本的标准化因子即可完成标准化

Independent Filtering

举个例子，

假设我有两个分布（两个分布之间有一定交集，但是95%是没有交集的），我随机从每个分布里面抽取3个数，计算它们均值的差异性（这里的差异性应当理解为差异小于某个阈值，则认为它们没有差异），因为数据来自两个分布，所以认为它们的均值是有差异的，那么如果我们抽取到那5%均值相等的部分，由于这些数据来自两个分布，但是在这5%交集部分（均值相等部分）本来是没有差异的，容易误判为有差异的，就像是分组问题一样，由于事先数据被label为两个分布，即使是数值上没有差异，也会被划分成有差异的两个组中去
我们认为这是小概率事件，认定为假阳性
简答理解就是即两批数据来自于不同的组，由于数值太接近，其实是没差异的，但是容易为误判为有差异的
另外我们还有个对照，

即抽样来自于同一个分布，由于数据来自于同一分布，这种情况我们认为它们的均值是没有差异的
那么模拟这个过程1000次，计算t-test的p_value
对于两个分布
我们发现993次抽样p_value显著，7次不显著
对于同一分布
其中有44个是有差异的，且p_value显著的，那么对于数据来自同一分布的来说，它们的均值是没有差异的，那么这44个就是误判的
所以我们联想到，数据来自于两个分布，993个差异中会有一部分是误判的，那么我们就依照来自同一分布的44个误判来做校正，即993-44=949
校正后，有949次是有差异的，这44个我们认为是假阳性的，因为来自同一分布，所以不该有差异

所以在RNA-seq差异分析里面，会有一部分假阳性的存在，所以应该去除
edgeR采取的方法是将2个重复及以上的基因（CPM > 1）的基因保留，其余的剔除

那么DESeq用的是CPM的分位数进行剔除

它是根据每种处理重复之间的平均CPM由大到小排序后，剔除某分位数一下的基因就可以了

因为表达量太低的这些基因很容易造成假阳性

参考：http://www.360doc.com/content/18/1007/19/51784026_792756710.shtml