什么时候使用Bismark的non_directional参数

Bismark是做甲基化数据分析常用软件，其中有一个--non_directional的参数，默认是不启用，如果需要时未启用该参数，会导致mapping rate下降近一半。

何时启用non_directional参数，得先明白这里的directional是什么意思。首先，这里的directional是指Illumina平台在测序时是directional的，和通常RNA-seq中directional建库是不同的两个概念。

一般建库流程，都是通过各种方法，在DNA/RNA两端加上测序用的adaptor，PCR扩增后，就可以在测序仪上开始测序。这里以Illumina经典的“Y”字形adaptor为例，黑色部分序列是反向互补的，绿色和黄色部分是不同的序列，不能互补配对，连上“Y”字形adaptor后经过PCR扩增，每个DNA分子两端就连上了不同的序列，如图中A和B两个DNA分子，一端是黄色序列，另外一端是绿色序列，这种结构是Illumina平台测序必需的结构。

在测序时，双链DNA会先分开形成两条单链，最后只有其中一条单链可以连接到测序芯片上，具体过程比较复杂，这里简化下，如图所示，只有5’端连了黄色序列的OT和OB两条单链DNA，在测序芯片上形成cluster，最后被测出其具体序列；而5’端连绿色序列的CTOT和CTOB，也就是PCR复制出来的两条链，是不能长到芯片上，所以CTOT和CTOB两条链的序列，最终是没有被测出来。Bismark称这种测序方式是directional的。

对于普通DNA测序来说，起始DNA分子的两条链OT和OB序列是反向互补的，PCR扩增后形成两个DNA分子，其中A分子中CTOT和OT是反向互补，B分子中CTOB和OB也是反向互补，所以其实CTOT=OB，CTOB=OT，测了OT和OB，也就是测了CTOB和CTOT，CTOT和CTOB未连上测序芯片也无所谓。但对于甲基化文库来说，DNA序列经过Bisulfite转化，CTOT和CTOB测不测就有关系了，因为这时不仅OT和OB的序列发生了变化，CTOT也不等于OB，CTOB也不等于OT，他们是四条和原始DNA完全不同的序列，且彼此之间也不一样。

甲基化DNA建库和普通DNA建库流程多了一步碱基转化步骤，未甲基化的C会被Bisulfite转化成U，而甲基化的C，也就是图中的mC，不会被转化，仍然是C，借此来鉴定原始DNA分子上哪些区域是甲基化修饰的。从图中可以看出，Bisulfite转化的DNA经过PCR扩增后，文库中四条序列跟原始的OT和OB都不一样。原始DNA分子中，OT的序列是“CGGC”，OB是反向互补的“GCCG”，转化后，OT变成“CGGT”，OB变成“GTCG”，新复制出来的CTOT是“ACCG”，CTOB是“CGAC”。最终测出来的只有转化后OT和OB，而CTOT和CTOB的序列虽然和其它的都不一样，但不能被测出来，丢失了其序列信息。

Bismark将测出来的reads map回基因组时，会将基因组序列根据Bisulfite转化OT和OB序列的规律，生成新的OT/OB基因组reference序列，这样序列转化后的OT和OB才能map回基因组。如果是上述的常规情况，因为测序过程是directional的，CTOT和CTOB都不会被测出来，所以就不用多此一举，尝试将测出来的reads往CTOT/CTOB reference上mapping，这个时候就是Bismark默认参数，不启用non_directional参数。多数甲基化数据是这一类型。

但是如果建库方式发生了改变，如下图，adaptor连接发生在Bisulfite转化之后，情况就发生了改变。

最后CTOT和CTOB的5’端都连上了黄色adaptor，也就是说他们都可以成功的在测序芯片上生成cluster，序列都会被测出来，这个时候测序数据里不仅仅是OT的“CGGT”和OB的“GTCG”，还有CTOT的“ACCG”和CTOB的“CGAC”，因此Bismark需要将测出来的序列尝试往四套reference上map，看到底是OT/OB/CTOT/CTOB中那一条，从而准确的将测出来的序列map回基因组。这个时候已经将四条链的序列都测出来了，相比于之前的只测出OB和OT两条链，就没有方向性，Bismark mapping时就需要启用non_directional参数。如果还是使用默认参数，不启用non_directional，测出来CTOT/CTOB序列很难mapping上基因组，导致最终mapping rate下降，没map上的这部分数据也没办法进入下游分析，造成数据浪费，有时甚至会导致最终结果产生偏差。

总之，什么时候启用non_directional参数，是和建库流程息息相关。就像上述例子中，如果是Bisulfite转化前就连了“Y”字形adaptor，那测出来的数据就是directional的，使用Bismark默认参数即可；如果是Bisulfite转化后再连“Y”字形adaptor，数据就变成non_directional了，用Bismark做mapping时需要启用该参数。分析前需要仔细了解建库流程，根据最终测序文库中CTOT和CTOB两条链的5’端，是否连上可以测序的adaptor序列，来判断数据是否是directional的，从而准确的设置Bismark mapping参数。