2020-11-24: 文献阅读: 压力超负荷驱动的心衰小鼠免疫浸润的单细胞转录组测序揭示了免疫激活程度

论文信息

Title: Single-Cell Sequencing of Mouse Heart Immune Infiltrate in Pressure Overload-Driven Heart Failure Reveals Extent of Immune Activation

Journal: Circulation

IF: 23.603

Publish date: 2019

Author: Martini, Elisa; Kunderfranco, Paolo

研究背景

炎症是心脏疾病的临床反应的重要组成之一，巨噬细胞和T淋巴细胞在心力衰竭的过程中发挥重要的作用。因此，通过调节免疫反应进而治疗心脏疾病成为了可能，但是心脏免疫细胞的活性却知之甚少，并且在压力超负载驱动下，心脏免疫细胞是如何变化的也是未知。

技术路线

• Pressure-overload transverse aortic constriction(TAC)的C57BL/6J小鼠模型，分别收集1和4周的TAC和Sham模型的CD45+(infiltration of immune cells)细胞用于单细胞转录组测序；

• 快速分离制备心脏CD45+的protocol以及设置duplicates增强分析可靠性；

• Seurat的graph based clustering算法聚类；

• Pearson correlation analysis分析聚类效果；

• 使用immune cell gene marker注释scRNA-seq的CD45+ cells；

• 堆积图展示免疫细胞簇丰度的ratio信息；

• fluorescence- activated cell sorting(FACS,荧光激活细胞分选办法)验证细胞簇biomarker；

• DESeq2识别差异基因；

• GSVA分析获取不同免疫细胞簇的pathway富集分数。

研究结果

1. 心脏组织拥有20类免疫细胞簇，这些细胞簇与疾病发展有密切相关关系。其中丰度前三的细胞群是macrophages/monocytes、B cells和Nature Killer cells。堆积图显示，免疫细胞簇的丰度随着疾病发展发生了变化，这说明心脏毒性免疫反应和多种免疫细胞相关，最后在整体上表现出炎症反应。

2. 根据CCR2的出现+或缺失-定义心脏巨噬细胞，定居()和游走()macrophage/monocytes。前者负责清除细菌及外来异物，后者负责招募促炎(proinflammatory)的macrophage/monocytes。Cluster 3富集，而Cluster 4 5 8则富集。进一步分析发现，cluster 3还特异表达与免疫相关的Cd163和Mrc1主要组织相容复合体II(major histocompatibility complex: MHC)。另外，cluster 4和8可能是骨髓来源的macrophage/monocytes，它们表达了促炎症因子oncostatin M (Osm)，该基因的过表达促进心脏器官功能障碍。

3. Sham和TAC组心脏均有大量B cells，根据四组B cells簇在疾病前后的丰度变化，发现cluster 2 11收到压力后激活。

4. 和(更重要)T细胞均在心衰心脏组织出现，flow cytometry验证了两类T细胞的整体丰度类似。unsupervised Reactome signature analysis 揭示 cluster 13 15与T cell receptor signaling pathways显著相关。

5. 整合所有免疫细胞的全局分析揭示 TAC和Sham的差异基因表达在疾病发展过程也是动态变化的，第一周和第四周 ll1b等促炎因子基因显著富集在疾病组，在第四周则出现了Ccr2和Cd68等新的促炎因子基因。最后在综合所有TAC和Sham分析，仍然发现类似的现象。

学习心得

1. 单细胞注释：准确地注释cell type对后续分析至关重要，文章结合marker gene 和簇相关对簇注释和合并；

2. 簇内进行子分类，每个分类的功能以及marker gene可以进一步解析；功能注释文章用到了unsupervised Reactome signature analysis；

3. 纵向数据可通过整体簇丰度变化阐明处理对基因的影响；

4. GSVA方法对功能富集分析有较大的帮助；

5. 生物学知识要相当丰富，文章针对是心衰的免疫解析，各类免疫细胞的属性要有详细的了解。TAC后 nature killer cell会增多。

问题和改进

1. 堆积图面积的变化能够真正说明免疫细胞丰度发生显著变化呢，并且这种变化是否具有临床学的意义呢？文章使用了drastic changes是否合适？

2. 文章提供的数据存在不严谨标记，TAC 1和4周应该是不同的样本，但它给出的标签是repA 和repB；

Citations

1. Martini, Elisa, et al. "Single-Cell Sequencing of Mouse Heart Immune Infiltrate in Pressure Overload–Driven Heart Failure Reveals Extent of Immune Activation." Circulation 140.25 (2019): 2089-2107.