NCBI的primer picker设计qRT-PCR染色法引物

搜索基因的mRNA序列

选择gene,搜索框中输入基因名称、human/其他物种,然后search
注意选择人类的基因,点进去

选择mRNA

向下滑动到mRNA and protein
此处有NRxxxxx数字,为NCBI给出的标准mRNA序列,选择一个点进去

  • tips,选择的时候可以去页面上方,看看实际图,对应的mRNA的在基因上的对应位置

再向下有NRxxxxx数字,这是非编码RNA的
再向下有NXxxxx数字,这是非NCBI认证的私人上传的mRNA序列

查询CDS序列

因为CDS序列比较保守稳定,引物最好设计在这个区域内,记住CDS对应的多少~多少,后边用

引物条件设定

点击页面右侧的primer picker
进入引物条件设定

qRT-PCR染色法——设定参数

  • 填写入CDS序列范围


    image.png
  • PCR product长度设定80-200


    image.png
  • 返回的引物对数,改成20
  • Max Tm difference改为2.5
  • 选择必须跨外显子-外显子


    image.png

防止残留的基因被引物扩增,对qPCR造成污染

  • 勾选在新页面打开
  • 提交引物设计
  • 若提示有匹配不同的转录本,可以选择100%的,或者不选,继续提交
  • 得到数对引物
  • 选择blast到别的位置比较少的引物对
  • Self 3‘ complementarity选择都在4以下的

得到的引物在oligo中验证

ps:新手上路,有错误敬请指正~

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