shRNA慢病毒载体合成步骤

要进行shRNA载体构建，首先需要根据自己的基因，设计出对应的靶点、loop序列，酶切位点序列，详见LncRNA的shRNA慢病毒载体引物设计 -

一.引物退火

引物先用10000g在4°离心2min，再按照说明书的要求，加入DEPC或者无酶ddH2O将寡核苷酸稀释为100 μM。

按以下体系配制退火反应体系：

无酶ddH2O补足 20 μl

正义寡核苷酸（100 μM） 2μl

反义寡核苷酸（100 μM） 2μl

10X T4 DNA连接酶缓冲液 1μl (这一步骤可选，也可不加，直接加无酶ddH2O)

一般来说，把小体积液体往大体积液体中加，相对会更准确，所以答主一般先加ddH2O。

退火反应程序：注意需要缓慢退火

1.PCR法：将配制好的退火反应缓冲液重复混合，瞬时离心后放置在PCR仪上，先95℃ 4min，再70℃ 10min，然后在数小时内缓慢冷却至室温。运行以下程序：95℃ 4min，70℃ 10min，55℃ 10min，40℃ 10min，25℃ 10min，10℃ 10min，4℃ ∞。

2.沸水烧杯法：把tube放在在PCR仪或沸水烧杯中95°C孵育4分钟，4min后将烧杯从火焰中取出，并让水自然冷却至室温。

二.骨架载体酶切+胶回收

酶切体系：（这里用的是NEB的酶和buffer）

①无酶ddH2O 或DEPC：补足至30uL

②plasmid：体积=5ug/质粒浓度

③10X cutsmart：3uL

④限制性内切酶1：2uL

⑤限制性内切酶2：2uL

胶回收：

本组用的是Omega gel extraction mini kit，E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit (V-spin) | Omega Bio-tek，超详细步骤可见过表达载体合成步骤 - 。

胶回收可以很大程度上避免DNA连接时发生载体自连的情况！

三.DNA连接+转化

DNA连接体系：

双链DNA寡核苷酸：5uL

骨架plasmid：150~200ng/胶回收后的plasmid浓度

T4 DNA连接酶：2uL

T4 DNA连接酶buffer：2uL

ddH2O补足至20uL

16℃连接，过夜or 4小时均可

质粒转化：

取连接产物与30ul 感受态细菌（对于慢病毒载体，最好选择stable3菌株，更有利于质粒稳定；而对于原核表达的载体，最好选择Rosetta菌株）混匀后冰浴30min，42℃热激90s，立即置冰上放置5min,加入预热至室温的700ul LB培养基， 37℃恒温培养30min，吸取 200ul的菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含50ug/ml Ampicillin抗性（根据骨架载体的特征来选，这里用的是pKLO.1质粒，因此选Amp）的LB平板上， 37℃恒温培养箱倒置培养过夜。

四.验证

1.在LB平板上挑出4~6个单克隆，加入LB培养基及筛选抗生素，37℃shake ，做质粒抽提。

2.测序验证

由于shRNA载体中的片段较小，一般只有几十个bp，因此，若要做双酶切验证，很可能看不到条带，直接做测序。