本文不知道出自何处，就是很厉害的样子，https://doi.org/10.1038/s41586-020-2623-z，喜欢的可以自行下载阅读。
摘要：癌细胞，包括黑色素瘤细胞，通常先通过淋巴系统区域性转移，然后再通过血液系统转移；然而，原因尚不清楚。在这里，我们显示淋巴中的黑色素瘤细胞比血液中的黑色素瘤细胞经历更少的氧化应激，并形成更多的转移。免疫功能低下的患者黑色素瘤小鼠和免疫功能正常的小鼠黑色素瘤小鼠在肿瘤引流淋巴中每微升的黑色素瘤细胞数比在肿瘤引流血液中的黑色素瘤细胞数多。通过血液转移的细胞，而不是通过淋巴转移的细胞，开始依赖铁死亡抑制剂Gpx4。静脉注射而不是淋巴内注射后，用化学铁死亡抑制剂预处理的细胞比未处理的细胞形成更多的转移。我们观察到淋巴液和血浆之间的多重差异可能有助于降低淋巴中的氧化应激和铁死亡，包括淋巴中更高水平的谷胱甘肽和油酸，以及更少的游离铁。油酸以ACSL3依赖的方式保护黑色素瘤细胞免于铁死亡，并增加其形成转移肿瘤的能力。与来自皮下肿瘤的黑色素瘤细胞相比，来自淋巴结的黑色素瘤细胞对铁死亡的抵抗力更强，在静脉注射后形成更多的转移。因此，暴露在淋巴环境中可以保护黑色素瘤细胞免受铁死亡的影响，并提高它们在随后通过血液转移期间的生存能力。
黑色素瘤和上皮性癌通常在形成远处转移之前在引流淋巴结中形成转移。人类和小鼠癌症(包括黑色素瘤)的遗传学研究表明，区域淋巴结转移有时会引起远处转移。与此一致的是，淋巴结中的癌细胞可以迁移到血管中，然后通过血液转移。然而，一些远处转移是从与采样淋巴结不同的克隆产生的。在这些情况下，是否发生远程转移尚不清楚。
在皮肤黑色素瘤患者中，区域淋巴结转移是远处转移和死亡的最重要的预测因子之一。彻底清扫淋巴结并不能提高存活率；然而，这并不一定意味着远处转移独立于淋巴系统发生，因为来自淋巴结的黑色素瘤细胞可能经常在区域转移被发现之前进入血液并扩散。越来越多的证据表明淋巴系统促进癌细胞的迁移和存活。一些癌细胞在淋巴结注射(结内注射)后比静脉注射后形成更多的肿瘤。血管内皮生长因子C(VEGF-C)和各种趋化因子促进癌细胞向淋巴管的迁移。脂肪酸的代谢能力促进了癌细胞在淋巴系统中的存活和转移肿瘤的形成。然而，循环中的癌细胞主要存在于血液中，关于这些细胞与淋巴管中的癌细胞进行比较的信息很少。虽然一些癌细胞在进入血液之前通过淋巴管迁移，形成远处转移，但暴露在淋巴中是否会影响这些细胞随后在血液中的存活尚不清楚。
血液转移是一个效率极低的过程，几乎没有癌细胞存活。限制生存的一个因素是氧化应激；然而，氧化应激是如何杀死转移细胞的尚不清楚。脂质氧化可引起铁死亡--一种细胞死亡模式，磷脂中的多不饱和脂肪酸被氧化还原活性铁氧化。虽然癌细胞在体内可以发生铁死亡，但大多数铁死亡的研究都是在培养条件下进行的，因此限制了我们对于在体内环境下铁死亡对肿瘤细胞的影响。
Increased survival of melanoma cells in lymph
我们高效(取自患者M405、M481和UT10)和低效(取自患者UM17、UM43和UM47)转移黑色素瘤(静脉注射和结内注射)给NOD.CB17-PrkdcsordIl2rgtm1Wjl/SzJ(NODSCIDγ；NSG)小鼠(表1)。在NSG小鼠异种移植后，高效的转移者会自发地引起血液中的循环癌细胞和远处转移，而低效的转移者会在更有限的范围内这样做(扩展数据表1a)。所有的黑色素瘤都用DsRed和荧光素酶标记，从而清楚地将这些细胞与受体小鼠细胞区分开来(流式细胞仪门控策略参见扩展数据图1a-d)，并能够通过生物发光成像对转移进行量化(扩展数据图1e-g)。与之前的研究一致，极限稀释分析显示，在NSG小鼠皮下注射后，有6/14形成肿瘤(表1)。同样与这项研究一致的是：静脉注射后形成转移肿瘤的细胞比皮下注射少得多：来自高效的转移者平均每373个细胞中就形成1个转移，而自低效的转移者每1658个细胞中就有1个转移。与静脉注射相比，注射到窝淋巴结中形成肿瘤所需的细胞明显更少：来自高效的转移者平均每58个细胞中就形成1个转移，来自低效的转移者平均每140个细胞中就形成1个转移(表1)。此外，这些结内注射比静脉注射引起更多的远处转移：来自高效的转移者平均每99个细胞中就形成1个转移，来自低效的转移者平均每497个细胞中就形成1个转移。
我们还通过移植小鼠黑色素瘤在免疫活性C57BL小鼠中进行了限制稀释分析。我们使用了两个耶鲁大学小鼠黑色素瘤(YUMM)细胞系28-YUM1.7(BRAFV600E/+Pten−/−CdK2−/−)和YUMM3.3(BRAFV600E/+CdK2−/−)，它们都是自发转移的(扩展数据表1b)。在皮下注射后平均每2,370个细胞形成1个肿瘤，在静脉注射后，每108,258个细胞形成1个转移肿瘤(表1)。在注射到窝淋巴结后，平均每606个细胞中就形成1个淋巴结肿瘤-明显多于皮下或静脉注射后形成的肿瘤(表1)。此外，这些结内注射比静脉注射(2904个细胞中有1个)引起更多的远处转移。因此，在免疫功能低下和免疫功能正常的小鼠中，黑色素瘤细胞在结内注射后存活和形成转移瘤的能力明显好于静脉注射(表1)。
为了比较淋巴和血液中自发转移的黑色素瘤细胞的数量，我们分别给NSG或C57BL小鼠皮下注射人或小鼠黑色素瘤。一旦皮下肿瘤直径达到2.0厘米左右，我们就用流式细胞仪测定同一小鼠的肿瘤引流血和淋巴以及远端血液和对侧淋巴中黑色素瘤细胞的数量(扩展数据图1H)。在人类(图1A)和小鼠(图1B)黑色素瘤中，我们始终观察到在肿瘤引流淋巴中每微升黑色素瘤细胞明显多于在肿瘤引流血液中的黑色素瘤细胞。我们通常能够在心脏穿刺获得的血液中检测到循环中的人类和小鼠黑色素瘤细胞，尽管它们的频率低于肿瘤引流血液中的黑色素瘤细胞。我们很少能在对侧淋巴中检测到黑色素瘤细胞。因此，黑色素瘤细胞在引流淋巴中比在引流血液中要丰富得多(图1A，b)。我们还在肿瘤引流的淋巴管中检测到低效转移的黑色素瘤细胞，但很少在血液中检测到(扩展数据图1I)。这增加了黑色素瘤细胞在淋巴中比在血液中存活更好的可能性。
我们测试了黑色素瘤细胞在淋巴中是否比血液中经历了更少的氧化应激。将人和小鼠黑色素瘤细胞移植到NSG或C57BL小鼠皮下，并允许其自发转移。同一小鼠皮下肿瘤、淋巴和血液中的黑色素瘤细胞用CellROX DeepRed染色，它检测活性氧物种(ROS)，包括羟自由基。对于免疫受损小鼠的患者来源的异种移植(图1C)和免疫功能正常小鼠的小鼠黑色素瘤(图1D)，
黑色素瘤细胞在血液中的ROS水平一直明显高于皮下肿瘤和淋巴中的ROS水平。细胞分离后用还原剂2-巯基乙醇处理，很大程度上挽救了活性氧水平的增加(扩展数据图2A)。因此，黑色素瘤细胞扩散到血液中与活性氧显著增加有关，而扩散到淋巴中则没有。(是不是说明肿瘤ROS升高是转移前的表现）
人（图1e）和小鼠（图1f）血液中的黑色素瘤细胞比来自皮下肿瘤或淋巴的黑色素瘤细胞表现出明显低的GSH与氧化谷胱甘肽（GSH/GSSG）的比率。淋巴黑色素瘤细胞和皮下黑色素瘤细胞之间的GSH/GSSG比值没有显著差异。
与此相一致，我们观察到淋巴液中的GSH浓度(图1g，h)和GSH/GSSG比值(图1i)显著高于血浆中的GSH浓度(图1g，h)和GSH/GSSG比值(图1i)。淋巴液中8-羟基-2‘-脱氧鸟苷(8-OHdG)氧化产物的浓度也较低(图1J)。因此，血液似乎是一个比淋巴更氧化的环境，这可能解释了血液中黑色素瘤细胞中ROS水平增加的原因。血液中更多氧化环境的原因尚不清楚，但可能反映了血液中的氧化水平高于淋巴，或者细胞成分或密度的差异。
Melanomas undergo ferroptosis in blood
将人黑色素瘤和小鼠黑色素瘤分别移植到NSG和C57BL小鼠皮下，并允许其自发转移。用BODIPY-C11流式细胞仪染色比较黑色素瘤细胞脂质ROS水平。对于大多数人(图2A)和小鼠(图2B)黑色素瘤，血液中的细胞比皮下肿瘤或淋巴中的细胞表现出明显更高的脂质ROS水平。为了测试我们研究的黑色素瘤是否可以发生铁死亡，我们用erastin和/或Liproxstatin-1进行培养，erastin通过抑制胱氨酸摄取来促进铁死亡，Liproxstatin-1通过减少脂质过氧化物的积累来抑制铁死亡。与对照培养相比，Erastin显著减少了细胞数量，Liproxstatin-1阻断了这一作用(图2C，d)。
促进脂质活性氧生成的铁是铁中毒所必需的。我们观察到血浆中游离铁的浓度比淋巴液中的浓度高得多(图2e)。用去铁胺(一种铁螯合剂)治疗，阻断了培养基中erastin清除黑色素瘤细胞的能力(扩展数据图2B，c)，这与铁死亡一致。
为了确定铁死亡是否限制了皮下肿瘤的生长，将人和小鼠黑色素瘤细胞分别移植到NSG和C57BL小鼠皮下。一旦肿瘤可触及，就每天给小鼠腹腔注射Liproxstatin-1或赋形剂。根据先前的报告，Liproxstatin-1对大多数黑色素瘤的皮下生长几乎没有影响(扩展数据图2D-h)。
这表明铁死亡并不限制已建立的皮下肿瘤的生长--这与这些肿瘤缺乏氧化应激是一致的。为了确定铁死亡是否限制了黑色素瘤细胞在血液中的存活，用赋形剂或Liproxstatin-1预处理黑色素瘤细胞，并将其静脉移植到小鼠体内。与载体预处理相比，Liproxstatin-1预处理显著增加了转移效率高的人(图2F)和小鼠(图2G)黑色素瘤的转移疾病负担。
用Liproxstatin-1预处理低效转移性黑色素瘤不足以增加转移性疾病负担(扩展数据图2I)。因此，铁死亡似乎限制了血液中高转移性黑色素瘤的生存，但其他机制可能有助于降低低效转移者的转移率，这与最近的一项研究一致。
为了检测铁死亡是否限制了黑色素瘤细胞在淋巴中的存活，用赋形剂或Liproxstatin-1预处理黑色素瘤细胞，并将其移植到小鼠窝淋巴结内。Liproxstatin-1预处理对结内注射后人(图2H)或小鼠(图2I)黑色素瘤的转移疾病负担没有显著影响。这表明黑色素瘤细胞在淋巴中的存活不受铁死亡的限制。用抗氧化剂N-乙酰-l-半胱氨酸或Trolox(维生素E类似物)预处理小鼠黑色素瘤细胞也显著增加了静脉注射后的转移疾病负担(图2J)，但结内注射没有显著增加(图2K)。
在静脉注射细胞之前，我们还用自噬(3-甲基腺嘌呤，一种磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂)、凋亡(VAD-FMK，一种泛caspase抑制剂)或坏死(GSK‘872，一种受体相互作用蛋白(RIP)激酶抑制剂)对小鼠黑色素瘤进行预处理。这些治疗对转移性疾病负担没有显著影响(扩展数据，图2J)。
为了从遗传学上测试铁死亡的重要性，我们使用CRISPR-Cas9从两个小鼠黑色素瘤中删除了编码谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)的基因(扩展数据图3A)。Gpx4，它通过减少脂质ROS的积累来抑制铁死亡，在我们研究的所有人和鼠黑色素瘤中都有表达(扩展数据图3A，b)。Gpx4的缺失并没有显著影响在生理氧水平下培养的小鼠黑色素瘤细胞的增殖或存活，但确实降低了在大气氧中培养的黑色素瘤细胞的存活或增殖(扩展数据图3C，d)，表明随着氧化应激的增加，Gpx4在黑色素瘤细胞中变得更加必要。（这里的生理氧环境如何模拟，生理氧条件下黑色素瘤细胞对GPX4的依赖性降低，低氧条件下是不是产生ROS会减少，在常氧条件下会增多？）
在体内，与亲本对照相比，Gpx4缺乏显著增加了皮下肿瘤中脂质ROS的水平(扩展数据图3e)。尽管如此，Gpx4的丢失仅略微减少了原发性皮下肿瘤的生长(扩展数据图3F，g)，但大大减少了血液中黑色素瘤细胞的频率(扩展数据图3H，I)，以及自发形成内脏转移肿瘤的小鼠的百分比(图2L)。
在这些实验中，由于黑色素瘤自发丧失了荧光素酶的表达，因此无法通过生物发光成像来量化总的转移性疾病负担。这些数据表明黑色素瘤细胞在转移过程中变得更加依赖Gpx4。在小鼠体内，Gpx4缺失和亲本的黑色素瘤也可以通过静脉和结内移植。Gpx4的缺失降低了静脉注射后在内脏器官形成转移肿瘤的小鼠的百分比(图2M)，但在结内注射后没有降低(图2N)。因此，Gpx4是血液中转移细胞生存所必需的，而在淋巴中并非必须，这进一步表明，铁死亡限制了血液中黑色素瘤细胞的生存。Gpx4缺乏对黑色素瘤细胞影响的依赖性强调了研究影响体内氧化应激反应的机制的价值。
Oleic acid protects against ferroptosis
为了更好地了解为什么黑色素瘤细胞在血液中发生铁死亡，而在淋巴中不发生铁死亡，我们将黑色素瘤移植到皮下，允许它们自发转移，然后使用流式细胞仪从同一小鼠的血液和淋巴中分离细胞进行代谢组学分析。主成分分析表明，来自淋巴的黑色素瘤细胞聚集在一起，与来自血液的黑色素瘤细胞分开(图3A)。与来自不同患者的黑色素瘤细胞相比，来自淋巴和血液的黑色素瘤细胞彼此之间的差异更大。我们对淋巴和血液中黑色素瘤细胞之间不同的代谢物进行了路径富集分析。前五条途径中有三条与脂质代谢有关(图3B)。磷脂的脂肪酸组成影响培养的癌细胞对铁死亡的敏感性。在我们检测到的57种脂质中，淋巴和血液中黑色素瘤细胞之间差异最大的脂质是油酸。淋巴比血液中油酸含量丰富，为8.7±0.9倍(Mean±S.D.)，(P<0.05)。油酸是一种单不饱和脂肪酸，它通过减少膜上可供氧化的多不饱和脂肪酸的数量或密度来抑制培养物中的铁死亡。
我们用油酸或亚油酸(一种多不饱和脂肪酸)处理小鼠和人类黑色素瘤细胞12小时，然后用erastin处理24小时，并对活细胞进行计数。油酸或亚油酸本身对细胞计数几乎没有影响，而在人类(图3C)和小鼠(图3D)黑色素瘤中，erastin显著减少了细胞计数。油酸-而不是亚油酸-保护细胞免受擦除素的影响，这表明油酸可以保护黑色素瘤细胞免受铁死亡的影响。为了验证油酸是否能促进黑色素瘤细胞在转移过程中的存活，我们用油酸、亚油酸或溶剂预处理黑色素瘤细胞12h，然后给小鼠静脉注射等量的活细胞。我们在接受油酸处理细胞的小鼠中观察到，在三个人类黑色素瘤中有两个(图3E)和在两个小鼠黑色素瘤中(图3F)，接受油酸处理的细胞的转移负荷明显高于赋形剂或亚油酸处理的细胞。因此，油酸预处理促进了大多数黑色素瘤在血液转移过程中存活的能力。
我们对血浆中最丰富的脂质进行了有针对性的脂质分析(扩展数据表2)。在我们分析的121种脂质中，37种在淋巴液和血浆之间有显著差异(P<0.01；扩展数据图4a，b)。其中15个三酰甘油在淋巴中含量更丰富，22个磷脂在血浆中更丰富。游离油酸水平极低(与先前的研究一致37)，在淋巴和血浆中没有明显差异。与血液相比，淋巴中三酰甘油和磷脂中的油酸总量的1.9±0.3倍(Mean±S.D.)。NSG小鼠的淋巴高出1.6±0.3倍，C57BL小鼠高1.6±0.3倍(图3g，h)。此外，淋巴中的油酸主要存在于三酰甘油中，而血浆中的油酸通常存在于磷脂中。大多数循环中的三酰甘油都包含在载脂蛋白B阳性(ApoB+)囊泡中，其中包括乳糜微粒体。为了验证载脂蛋白B+囊泡中是否含有油酸的三酰甘油，我们从小鼠的血浆或淋巴液中分离出载脂蛋白B+囊泡。几乎所有的三酰甘油和油酸都包含在载脂蛋白B+而不是载脂蛋白B−组分中。在淋巴ApoB+组分中油酸含量比在血浆ApoB+组分中更丰富。
为了确定油酸对黑色素瘤细胞的保护作用是否需要膜掺入，我们测试了这是否需要酰基辅酶A合成酶长链家族成员3(ACSL3)。ACSL3能将脂肪酸转化为脂肪酰辅酶A酯，并结合到膜磷脂中，保护细胞在培养过程中免受铁死亡的侵袭。黑色素瘤中ACSL3的高表达，高表达与患者的总体生存率较差有关。ACSL3在大多数人和小鼠黑色素瘤中表达，包括所有高效的转移者(扩展数据图5a，b)。低效的转移者有时几乎不表达ACSL3(扩展数据图5A)，这增加了它们对油酸影响不太敏感的可能性。
我们使用CRISPR-Cas9从两个小鼠黑色素瘤中删除了ACSL3(每行两个独立的靶向克隆；扩展数据图5B)。ACSL3的缺失显著减少了油酸在磷脂中的掺入，这可以通过野生型Ascl3的过表达来挽救，但不能通过编码ACSL3的突变版本来拯救(扩展数据图5C，d)。ACSL3缺失显著增加了皮下肿瘤的脂质活性氧水平，但对肿瘤的增殖或存活没有显著影响(扩展数据图5e，f)。
为了测试油酸是否需要ACSL3来保护细胞免受铁死亡的影响，我们用油酸处理ACSL3缺失或亲本黑色素瘤12小时，然后用Erastin处理24小时，并对活细胞进行计数。油酸阻断了erastin对亲本对照细胞的影响(图3D)，但不能保护缺乏ACSL3的细胞免受erastin的影响(图3i，j)。油酸的保护作用通过过表达野生型ACSL3而不是突变型ACSL3来恢复(扩展数据图5G，h)。油酸因此以ACSL3依赖的方式阻断了erastin对黑色素瘤细胞的作用。与亲本对照细胞相比，结内注射ACSL3缺失细胞可显著降低转移(扩展数据图5I)。
我们还检测了SLC7A11(半胱氨酸和谷氨酸转运蛋白)、ACSL4(酯化长链脂肪酸进行脂质生物合成)和铁死亡抑制蛋白1(FSP1)的表达，每种蛋白都可以影响铁死亡的敏感性。SLC7A11和ACSL4在我们研究的所有黑色素瘤中都有不同程度的表达(扩展数据图6a-d)。FSP1在黑色素瘤的子集(例如，M405和M481)表达，但其他黑色素瘤几乎没有表达(UT10，YUMM1.7和YUMM3.3；扩展数据图6e，f)。通过定量PCR和逆转录(qRT-PCR)(扩展数据图6g)，我们观察到来自淋巴和血液的黑色素瘤细胞中FSP1(也称为AIFM2)的转录水平没有差异。不同黑色素瘤间SLC7A11、ACSL4和FSP1表达水平的差异可能影响对铁死亡的敏感性。
黑色素瘤表达多种能够转运油酸的脂肪酸转运蛋白，包括FATP1、FATP3、FATP4和FATP5(也分别称为SLC27A1、SLC27A3、SLC27A4和SLC27A5)(扩展数据图6H)。FATP2保护髓样细胞免受脂质活性氧的影响，改变免疫功能和黑色素瘤进展。另一种脂肪酸转运蛋白CD36可以通过促进棕榈酸摄取促进口腔癌的转移，尽管我们在我们研究的黑色素瘤中没有检测到CD36(扩展数据图6I)。
Lymph protects cells from ferroptosis
这些结果提出了淋巴结转移通常先于远处转移的可能性。为了验证这一点，我们从同一供体小鼠的原发性皮下肿瘤和淋巴结转移中分离出小鼠黑色素瘤细胞，并将它们静脉移植到二次受体体内。与来自皮下肿瘤的黑色素瘤细胞相比，来自淋巴结的黑色素瘤细胞更容易形成转移肿瘤(图3k)。为了测试这种差异是可逆的还是不可逆的，我们从原发性皮下肿瘤和淋巴结转移中分离出黑色素瘤细胞，然后将细胞连续移植到皮下，然后静脉注射。短暂的皮下生长消除了淋巴结来源细胞相对于皮下肿瘤来源细胞的转移优势(图3k)。此外，在培养中，来自淋巴结转移的黑色素瘤细胞通常比来自皮下肿瘤的细胞对Erastin更具抵抗力(图3L，m)。静脉注射实验表明，癌细胞有可能通过血液转移，显然不依赖于淋巴，但这是一条比通过淋巴转移效率低得多的途径，特别是在免疫能力强的宿主中(表1)。我们研究的大多数(但不是全部)黑色素瘤在油酸治疗后形成了更多的转移。这表明，一些黑色素瘤被保护免受淋巴中氧化应激的机制是独立于外源性油酸的-潜在的包括其他抗氧化剂水平的增加，内源性脂肪酸的产生或FSP1介导的机制。总体而言，淋巴似乎通过减少氧化应激来保护转移细胞免受铁死亡的侵袭，从而提高它们在随后通过血液的迁移过程中的存活率(扩展数据，图6J)。
文章到此结束，说了两个方面：铁死亡和脂代谢，你觉得这个文章能发几分？欢迎批评、指正。