NGS001 NGS常用酶

DNA聚合酶（DNA介导的DNA聚合酶）

T4 DNA聚合酶

概述：在模板及引物存在的条件下，T4 DNA聚合酶催化沿5´→3´方向合成DNA。此酶还具有3´→5´外切核酸酶的活性，该活性比DNA聚合酶I强。与DNA聚合酶I不同，T4DNA聚合酶不具有5´→3´核酸外切酶活性。
应用：缺口填充（无链置换活性）；切除3´突出末端或补平5´突出端，形成平末端；通过置换合成法标记探针；单链删除后亚克隆
反应条件：11℃孵育20分钟，或室温(20-25℃)孵育5分钟；75℃孵育20分钟失活。
注意事项：由于该酶具有3´→5´核酸外切酶的活性，提高反应温度、增加酶量、没有加入dNTP或反应时间过长都可能造成DNA末端碱基被切除形成凹陷。

DNA聚合酶I（E.coli）

概述：DNA聚合酶I（E.coli）是依赖于DNA的DNA聚合酶，具有3´→5´和5´→3´核酸外切酶活性。该酶的5´→3´核酸外切酶活性能够切除位于延伸链前端的核苷酸，从而使切刻平移成为可能
应用：DNA切刻平移；cDNA第二条链的合成
反应条件：75℃孵育20分钟失活。
注意事项：切刻平移反应时需额外添加DNaseI

DNA聚合酶I（Klenow）大片段

概述：DNA聚合酶I，大片段（Klenow片段）是E.coliDNA聚合酶I的蛋白水解产物，具有DNA聚合酶活性和3´→5´核酸外切酶活性，但缺失了5´→3´核酸外切酶活性。Klenow既保留了全酶的高保真性，又不会降解DNA5´末端
应用：用随机引物制备探针；切除3´突出端或补平5´突出端，形成平末端；cDNA第二条链的合成；
反应条件：75℃孵育20分钟失活
注意事项：由于该酶具有3´→5´核酸外切酶活性，升高反应温度、加入过量的酶、未加入dNTP或反应时间过长均会导致DNA末端碱基被切除形成凹陷

Klenow片段（3'→5'exo-）

概述：Klenow片段（3´→5´exo-）是DNA聚合酶I的N末端截短物，它保留了DNA聚合酶活性，但失去了5´→3´核酸外切酶活性。该酶经突变（D355A，E357A）去除了其3´→5´的核酸外切酶活性（1）
应用：用随机引物制备探针；随机引物法标记；cDNA第二条链的合成
反应条件：75℃，20分钟
注意事项：Klenow片段（3´→5´exo-）因去除了3´→5´核酸外切酶的活性，故不适用于生成平末端的反应。

T7 DNA聚合酶

概述：天然T7 DNA聚合酶由两个亚基组成：T7基因5蛋白（聚合酶活性及3´→5´外切酶活性）和E.coli硫氧还蛋白（辅助蛋白，增强T7基因5蛋白对模板的亲和能力），使得DNA的合成可延伸至上千个核苷酸，相比于大肠杆菌DNA聚合酶I，Klenow片段及T4DNA聚合酶，它的延续合成能力高得多。经修饰后的T7DNA聚合酶，去除3´→5´外切酶活性，增强了延续合成及消除二级结构影响的能力，是一种理想的DNA序列测定用酶
反应条件：37℃孵育。75℃孵育10分钟失活
注意事项：该酶具有快速延伸的特性，T7DNA聚合酶不能用于DNA测序。

末端转移酶（TdT）

概述：末端转移酶（TdT）是一种不依赖于模板的 DNA 聚合酶，可以催化在寡核苷酸、单链或双链DNA的3'羟基端加上dNTP。
应用：催化DNA的3´末端添加同聚物；利用修饰碱基（如ddNTP，DIG，dUTP）标记DNA3´末端；TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（细胞凋亡的原位检测）；TdT依赖的PCR

Taq DNA聚合酶

概述：Taq DNA Polymerase简称Taq酶，是最常用的DNA聚合酶之一。是一种来源于嗜热菌Thermus aquaticus的高度热稳定的DNA聚合酶，95℃孵育时的半衰期大于40分钟。Taq酶可以催化5'至3'方向的依赖于DNA模板的脱氧核苷酸的聚合。Taq酶没有3'至5'的外切酶活性，有非常低的5'至3'外切酶活性。由于Taq酶没有3'至5'的外切酶活性，因此在DNA聚合过程中相当于核苷酸转移酶的作用，最终会导致PCR产物的3'末端会产生3'-dA overhangs，即产生带一个A的3'粘端。
应用：PCR、DNA标记和测序等。Taq酶最长可以扩增长达8kb的DNA片段，通常适合扩增3kb以下的DNA片段。Taq酶扩增产生的PCR产物带有3'-dA overhangs，可以用于基于T载体的PCR片段克隆。PCR反应过程中可以掺入生物素、地高辛或一些荧光机团标记的脱氧核苷酸，即可以用核酸的标记反应。Taq酶还可以用于DNA测序。

Taq热启动DNA聚合酶

热启动Taq DNA聚合酶是一种采用化学修饰或者抗体结合封闭酶活性中心的重组Taq DNA 聚合酶，该酶在室温下没有活性，避免形成引物二聚体和非特异性延伸，95℃加热激活后可恢复酶活性，活化的酶具有与Taq DNA聚合酶相同的功能。

等温扩增和链置换

phi29 DNA聚合酶

概述：phi29 DNA 聚合酶是从嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的噬菌体 phi29 中克隆出的 DNA聚合酶。此酶具有卓越的链置换和连续合成特性，并具有 3´→5´ 核酸外切酶校读活性，可连续合成长达70kb的DNA片段。
应用：催化双链DNA 5’末端单核苷酸的移除；应用于需要强链置换和/或连续合成的复制反应；中温条件下高保真复制
反应条件：该酶的最佳反应温度为30℃， 65℃孵育10分钟即可使该酶失活

Bst DNA聚合酶，大片段

概述：BstDNA聚合酶，大片段是BacillusstearothermophilusDNA聚合酶的一部分，具有5´→3´DNA聚合酶活性，但缺失5´→3´核酸外切酶活性。
应用：DNA等温扩增；富含GC区域的DNA测序；纳克级DNA模板的快速测序；可用于要求嗜温链置换的实验
反应条件：80℃孵育20分钟失活
注意事项：建议反应温度不要超过70℃。BstDNA聚合酶，大片段不能用于热循环测序或PCR。

cDNA合成

反转录酶

反转录酶都具有多种酶活性，主要包括

RNA指导的DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。
RNaseH活性；由反转录酶催化合成的cDNA-RNA杂交分子，将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。
DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，合成第二条DNA分子。

AMV 反转录酶

概述：禽骨髓母细胞瘤病毒（AMV）反转录酶是一种RNA介导的DNA聚合酶。该酶能以RNA（合成cDNA时）或单链DNA为模板从引物开始合成互补的DNA链。
应用：cDNA第一链的合成，RNA测序。
反应条件：由于AMV RT在较高反应温度下较稳定(37-58℃)，特别适用于具有复杂二级结构的模板的逆转录。
注意事项：解冻后贮存于-20℃。反复冻融会导致酶失活。长时间贮存可分装后置于-70℃

M-MuLV反转录酶

概述：莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MuLV）反转录酶是一种RNA介导的DNA聚合酶。该酶能以RNA（合成cDNA时）或单链DNA做模板由引物起始合成一条互补的DNA。M-MuLV反转录酶无3´→5´核酸外切酶活性。
应用：第一链cDNA合成，用于RT-PCR和实时RT-PCR。合成cDNA，用于克隆和表达研究。制备芯片研究用标记的cDNA探针。DNA标记。引物延伸法分析RNA
反应条件：最佳活性温度为42℃。温度高达50℃时仍有活性。70℃孵育10分钟失活

DNA修饰酶

T4 多聚核苷酸激酶

概述：T4多聚核苷酸激酶能够催化ATP的γ-位磷酸基团转移到寡核苷酸链（双链或单链DNA或RNA）的5´-羟基末端以及3´-单磷酸核苷上。T4多聚核苷酸激酶（NEB#M0201）还具有3´磷酸酶活性，将3´-磷酸基团从寡核苷酸的3´磷酸末端、脱氧3´-单磷酸核苷和脱氧3´-二磷酸核苷上水解掉。经修饰后的酶（NEB#M0236）具有所有激酶的活性，但是缺失了3´磷酸酶活性
应用：DNA或RNA5´末端的磷酸化，以便进行连接反应；DNA或RNA的末端标记，用作探针和进行DNA测序；用T4多聚核苷酸激酶除去3´磷酸基团；
反应条件：37℃孵育；65℃孵育20分钟失活
注意事项：要提高平齐末端或5´凹陷末端的磷酸化效率，可在加入T4多聚核苷酸激酶前，先将DNA溶液于70℃加热5分钟，然后冰上冷却，并加入5%（W/V）的PEG-8000。T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能发挥活性，但是为了适用于高活力的放射性标记反应，在随酶提供的反应缓冲液中不含ATP。一般来说，进行激酶反应之后是连接反应。在这种情况下，T4多聚核苷酸激酶反应在连接酶反应缓冲液中37℃温育30分钟即可。反应后的产物可直接进行连接，无需改变缓冲液和进行热失活。如果连接时需要保持其它DNA片段的去磷酸化状态，则需要在连接反应前热失活T4多聚核苷酸激酶。

小牛肠碱性磷酸酶（CIP）

概述：小牛肠碱性磷酸酶（CIP）催化DNA和RNA5´和3´磷酸单脂的去磷酸化反应。另外，CIP水解核糖和脱氧核糖核苷三磷酸（NTP和dNTP）。CIP在分子生物学研究中应用广泛，如去除DNA和RNA末端的磷酸基团，用于后续的克隆和探针末端标记。在克隆中，对线性载体去磷酸化，防止自连。该酶可以作用于5´突出端、凹陷端和平末端。CIP也可以用来降解PCR反应中的游离dNTP，用于制备测序模板和SNP分析。
应用：DNA和RNA的去磷酸化；克隆载体去磷酸化，防止载体自连；测序或SNP分析前除去PCR反应中dNTP和焦磷酸盐T4 PNK标记5´DNA末端前的去磷酸化
反应条件：37℃ 温育

虾碱性磷酸酶（rSAP）

概述：虾碱性磷酸酶（rSAP）是热敏感的重组碱性磷酸酶，rSAP与野生型酶一样，不包含任何亲和标签或其他修饰。rSAP非特异性的催化DNA和RNA5´和3´磷酸单脂的去磷酸化反应。另外，rSAP水解核糖和脱氧核糖核苷三磷酸（NTP和dNTP）。rSAP在分子生物学研究中应用广泛，如去除DNA和RNA末端的磷酸基团，用于后续的克隆和探针末端标记。rSAP也可以用来处理PCR反应中的dNTP，用于制备测序模板和SNP分析。rSAP在65℃温育5分钟即可完全、不可逆失活，因此，在连接或末端标记之前，可以不用去除rSAP
应用：DNA和RNA的去磷酸化；克隆载体去磷酸化，防止载体自连；测序或SNP分析前除去PCR反应中dNTP和焦磷酸盐T4 PNK标记5´DNA末端前的去磷酸化
反应条件：37℃温育， 65℃温育5分钟失活。

无机焦磷酸酶（大肠杆菌）

概述：无机焦磷酸酶（E. coli）催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐
应用：反转录反应中提高RNA 产量，增强DNA复制

ATP 硫酸化酶

概述：ATP硫酸化酶通过转移硫酸根至ATP的腺嘌呤单磷酸基团，形成腺苷-5´-磷酰硫酸（APS）和焦磷酸（PPi），从而催化硫酸根的活化。该反应是可逆的：ATP硫酸化酶也可以催化APS和PPi合成ATP。
应用：高效将ATP转化为AMP；在DNA测序循环中去除脱氧核糖核苷酸；将5´端三磷酸化的RNA转化为可连接的单磷酸化RNA；将5´端三磷酸化的RNA转化为单磷酸RNA
反应条件：37℃温育， 65℃温育20分钟失活。

DNA连接酶

T4 DNA 连接酶

概述：该酶催化双链DNA或RNA上相邻的5´-磷酸末端和3´-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化平齐末端或粘性末端之间的连接，还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切刻。
应用：高效连接粘性末端和平末端；T/A克隆；dsDNA切刻修复；构建高丰度克隆文库；RNA和DNA的连接
反应条件：16℃温育，65℃孵育10分钟灭活
注意事项：与E.coliDNA连接酶需要NAD+作辅因子不同，T4DNA连接酶的辅因子是ATP。

T7 DNA 连接酶

概述：T7 DNA连接酶来源于T7噬菌体，它是一种ATP依赖型双链DNA连接酶，该酶可催化双链DNA相邻5´磷酸末端和3´羟基基团之间形成磷酸二酯键。T7DNA连接酶可以有效地催化粘性末端和切刻的连接。与T4和T3DNA连接酶不同，T7DNA连接酶不能有效地催化平末端连接。因此，在实验过程中，当平末端和粘性末端同时存在时，仅需粘性末端发生连接，T7DNA连接酶是理想的选择。
应用：仅用于连接粘性末端，dsDNA切刻修复
反应条件：25℃温育，65℃孵育10分钟灭活
注意事项：ATP是必需的辅助因子。

T3 DNA 连接酶

概述：T3DNA连接酶来源于T3噬菌体，是ATP依赖型双链DNA连接酶，可以有效催化粘性末端、平齐末端和切刻的连接。加入PEG6000可提高平齐末端连接效率。T3DNA连接酶在反应中对NaCl的耐受性是T4DNA连接酶的2倍，因此，当体外分子生物学实验中需要考虑实验离子浓度下DNA连接酶活性时，就多了一个选择。
应用：连接粘性末端或平末端，高盐耐受力，dsDNA切刻修复
反应条件：25℃温育，65℃孵育10分钟灭活
注意事项：ATP是必需的辅助因子。

E. coli DNA 连接酶

概述：催化双链DNA粘性末端的5´-磷酸和3´-羟基形成磷酸二酯键。不能有效连接平末端底物。E.coliDNA连接酶以NAD为辅因子。在4-37℃范围内，E.coliDNA连接酶均有活性。
应用：dsDNA切刻修复，cDNA克隆
反应条件：16℃温育，65℃孵育20分钟灭活
注意事项：该酶以NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为辅因子。该酶对平末端片段的连接效率极低

SplintR® 连接酶

概述：SplintR连接酶也称为PBCV-1DNA连接酶或Chorella病毒DNA连接酶，它能够高效催化相邻的DNA核苷酸的连接，这个连接过程需要一条互补的RNA在两条DNA单链间起“夹板”或“桥梁”的固定作用。这种以前没有报道过的活性可能推动一些创新性miRNAs和mRNAs，包括SNPs的分析方法。在二代测序和分子诊断等众多领域中，SplintR是富集目的基因的理想选择。它具有稳定的生物活性，对RNA介导固定的DNA底物亲和性强（米氏常数Km=1nM），能够在复杂的混合物中检测到亚纳摩尔级的特定RNA。因此，在RNA检测技术中，SplintR连接酶不失为最佳选择用酶。
应用：连接被互补RNA固定的相邻的单链DNA；鉴定miRNAs和mRNAs，包括SNPs
反应条件：最佳反应温度是16℃，65℃孵育20分钟灭活

核酸内切酶及外切酶

分类方式

核酸内切酶 endonuclease 核酸内切酶是在核酸水解酶中，水解DNA分子链内部磷酸二酯键生成寡/寡聚核苷酸的酶。从对底物的特异性来看，可分为DNaseⅠ、DNaseⅡ等仅分解DNA的酶；脾脏RNase、RNaseT1等仅分解RNA的酶；还有就是如链孢霉（Neurospora）核酸酶这类既分解DNA又分解RNA的酶。一般来说，大都不具碱基特异性，但也有诸如HindⅢ、EcoRⅠ等具有限制性的，能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。
核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。分为水解权磷酸二酯键的3′端生成5′-单核苷酸的酶，及水解5′端生成3′-单核苷酸的酶。前者有蛇毒磷酸二酯酶及大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等；后者有脾脏磷酸二酯酶、嗜酸乳杆菌核酸酶

NEB核酸内切酶及核酸外切酶特点

NEB核酸内切酶及外切酶应用

RNA酶

核糖核酸酶H

概述：RNaseH是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。RNaseH不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链DNA或RNA。
应用：特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA，常用于cDNA第二链的合成
反应条件：37℃孵育。加入0.5MEDTA(pH8.0)终止反应。

核糖核酸酶A

概述：核糖核酸酶A是内切核糖核酸酶，可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3'端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。反应终产物是嘧啶3'磷酸及末端带嘧啶3'磷酸的寡核苷酸。无辅因子及二价阳离子存在时，核糖核酸酶A的作用可被胎盘RNA酶抑制剂(B1ackburn et al．1977)或氧钒—核糖核苷复合物(Puskas et al．1982)所抑制。
应用：核糖核酸酶A（RNase A）最常见的应用在于质粒DNA或基因组DNA制备过程中去除RNA

核糖核酸酶T1

概述：核糖核酸酶T1（RNase T1）来源于米曲霉（Aspergillus orjzae），它特异地作用于鸟嘌呤3’端磷酸，切割位点在鸟嘌呤的3’磷酸和相邻核苷酸的5‘羟基之问的磷酸二酯键，反应终产物为3’鸟苷酸和末端带3’鸟苷酸的寡核苷酸片段。RNaseTl的反应条件极广，且极难失活，其催化活性类似于RNase A。

核糖核酸酶R

概述：RNase R是一种核糖核酸外切酶，广泛应用于circRNA的鉴定、富集和相关实验，RNase R来源于大肠杆菌RNR超家族，可以从3’-5’方向切割降解RNA，能够消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化呈环形的RNA、套索结构或3’端突出末端少于7 nt的双链RNA分子（Cheng ZF et al., 2002）。

RNaseR作用机制

RNA 连接酶

已报道的RNA连接酶

RNA连接酶选择

RNase抑制剂

人胎盘RNase抑制剂
RNase抑制剂是重组人胎盘蛋白质，可以特异性地抑制RNaseA、B、C活性，但对RNase1、RNaseT1、S1核酸酶、RNaseH和来源于曲霉属的RNase无效。此外，与下列聚合酶共同使用时，未观察到其抑制聚合酶的活性，如：TaqDNA聚合酶、AMV或M-MuLV反转录酶和噬菌体RNA聚合酶（SP6、T7或T3）。
小鼠RNase抑制剂
小鼠RNase抑制剂是鼠源重组蛋白，分子量为50kDa，可以特异性抑制RNaseA、B和C活性。它与RNase以1:1的比例高效非共价结合从而抑制其活性。但对RNase1、RNaseT1、S1核酸酶、RNaseH或来源于曲霉属的RNase无效。此外，与下列聚合酶共同使用时，该抑制剂不会抑制聚合酶的活性，如：TaqDNA聚合酶、AMV或M-MuLV反转录酶或噬菌体RNA聚合酶（SP6、T7或T3）。
重组小鼠RNase抑制剂不含有半胱氨酸。已证实，人源中的半胱氨酸对氧化非常敏感并导致抑制剂失活。因此，小鼠RNase抑制剂与人/猪RNase抑制剂相比，抗氧化能力显著提高，且在DTT浓度较低（＜1mM）时更稳定。这使其在不适宜高浓度DTT的反应中更具优势，如实时RT-PCR。
氧钒核糖核苷复合物
氧钒核糖核苷复合物是通过Berger改良方法将四种rNTP的等摩尔混合物与氧化钒IV混合而成（1）。每一批复合物都要经过氧化钒V成分以及RNase活性抑制的检测。
氧钒复合物可用在mRNA的纯化过程中，作为外源RNase的抑制剂。也可在细胞裂解和蔗糖梯度细胞质成分分离过程中，抑制RNase活性。

reference
1.http://www.neb-china.com/index.asp
2.NEB catlog:https://international.neb.com/support/catalog-and-literature-request